摘要：目的检测呼吸疾病患者肺内肺孢子菌基因阳性率,探讨肺孢子菌定植或感染的影响因素及其与呼吸系统疾病的相关性。方法设计3对特异性引物,构建检测肺孢子菌16SrRNA基因的LAMP反应体系。通过对大鼠感染模型的肺孢子菌基因检测,验证其敏感性和特异性;通过对临床呼吸疾病患者痰液样本肺孢子菌基因的检测,分析肺孢子菌感染或定殖与呼吸系统疾病的相关性及其影响因素。结果本研究建立的LAMP方法检测肺孢子菌16SrRNA基因的最低检测极限为50copies/mL;与念珠菌等8种呼吸道病原体不发生交叉反应。共收集和检测98例呼吸疾病患者痰标本,肺孢子菌基因总检出率为63.3%(62/98)。合并呼吸道感染者63例,非合并感染者35例,肺孢子菌基因阳性率分别为60.3%和75.0%,χ2检验两者差异有统计学意义。肺部影像学有改变者肺孢子菌基因检出率为72.5%,肺部影像学无改变者检出率为53.19%,χ2检验两者具有显著性差异。COPD和非COPD患者肺孢子菌基因检出率分别为53.2%和71.2%,χ2检验两者无显著性差异;COPD急性发作期和稳定期阳性率分别为66.8%和46.9%,χ2检验两者差异无统计学意义。CD4+T淋巴细胞数降低患者肺孢子菌基因检出率80.0%;CD4+T淋巴细胞数正常者的检出率为60.27%,χ2检验两者差异具有统计学意义。1,3-β-D-葡聚糖血含量升高和含量正常患者的肺孢子菌基因检测结果显示,χ2检验两者差异无统计学意义。结论呼吸疾病患者中肺孢子菌基因检出率较高。两者是否有直接的因果关系尚需进一步研究。合并其他细菌感染者肺孢子菌基因阳性率较低,其机制有待于进一步研究。CD4+T细胞数降低者肺孢子菌基因阳性率升高,符合肺孢子菌为机会感染的特点。

摘要：目的建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法,研究其在实验动物肺孢子菌感染模型的检测效果及其敏感性和特异性,以期为临床提供检测肺孢子菌定植或感染的新方法。方法依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物,建立并优化检测肺孢子菌基因的巢式PCR体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象,比较mtLSU巢式PCR与六亚甲基四胺银(GMS)染色法检测肺孢子菌的阳性率及符合率。对阳性标本进行DNA纯化,构建分子克隆,采用倍比稀释法检测mtLSU巢式PCR的敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体(光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体)为对照,检测方法的特异性。结果肺印片GMS染色镜检实验组大鼠,14只查到肺孢子菌包囊,检出率为70.0%(14/20),对照组检出率为0(0/20)。用mtLSU巢式PCR均能检测实验组大鼠肺孢子菌基因,阳性率为100%(20/20),对照组均为阴性。mtLSU巢式PCR法阳性率与GMS染色法比较差异有统计学意义(P<0.05)。敏感性检验结果表明,mtLSU巢式PCR检测最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检测显示,其他8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。结论成功建立了检测肺孢子菌基因的mtLSU巢式PCR方法,动物模型检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强,有望应用于临床患者标本中肺孢子菌的基因检测。