摘要：为建立布鲁菌的快速检测方法,通过引物设计、PCR扩增、表达载体构建、SDS-PAGE和Western-blot分析对牛布鲁菌3种外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28基因进行原核表达,利用亲和层析法纯化3种重组蛋白,将3种重组蛋白混合作为包被抗原,经重复性、灵敏度和特异性试验建立了布鲁菌抗体检测间接ELISA,并对300份牛血清样品进行检测应用,同时使用进口的商品化试剂盒进行平行检测。结果显示,成功构建了p Cold-TF/OMP19、p Cold-TF/OMP22和p Cold-TF/OMP28原核表达载体,诱导后分别表达大小分别为69、74和80 ku的可溶性且具有良好反应原性的重组蛋白r OMP19、r OMP22和r OMP28。基于此3种重组蛋白混合抗原建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,其灵敏度达1∶1 600。临床样品检测试验结果显示,与进口试剂盒总符合率高达96%(288/300),其中阳性符合率为93.5%(58/62),阴性样品符合率为96.64%(230/238)。将3种重组外膜蛋白联合作为包被抗原进行牛布鲁菌抗体检测,为我国牛布鲁菌病的诊断检测技术相关研究提供了新的思路和参考。

摘要：[目的]本试验旨在建立肌肉生成抑制素基因(myostatin,MSTN)敲除猪的快速检测方法,为该品系转基因猪及其产品的检测提供技术支持。[方法]根据猪β2-微球蛋白基因(β2-microglobulin,B2M)设计猪内源性基因引物,标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferaseⅡ,NPTⅡ)和测定的边界序列设计特异性引物,对引物的量进行调整,优化反应条件。对PCR的敏感性和特异性进行检测,并应用建立的方法对随机选取的32份猪肺和脾脏组织样品进行检测,均仅扩增出B2M条带。[结果]该方法的最佳退火温度为56℃,最低能检测出含1%MSTN基因敲除基因组成分的样本,对32份组织样本仅扩增出B2M条带。[结论]建立的多重PCR方法敏感、特异,在一个反应中能检测多个基因片段,可用于MSTN基因敲除猪的检测,为此品系转基因动物检测标准的建立提供依据。

摘要：目的将免疫磁珠分离技术(IMS)和荧光探针定量PCR(qPCR)相结合,建立水源性微小隐孢子虫卵囊的检测方法。方法以抗微小隐孢子虫卵囊表面抗原Cp23单克隆抗体包被链霉素磁珠,制备特异免疫磁珠,根据卵囊回收率优化分离和富集卵囊条件。根据微小隐孢子虫核糖体DNA小亚基(18S rDNA)基因(登录号AB513881.1)序列设计引物和荧光标记探针,以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,将扩增产物克隆至Peasy-T1载体。经筛选鉴定后,将重组质粒倍比稀释至104～108copy/μl,荧光探针定量PCR检测,并绘制标准曲线。用荧光探针定量PCR分别检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬隐孢子虫和大肠埃希菌基因组DNA,判断该方法的特异性;检测100～108copy/μl重组质粒,判断该方法的敏感性。对采自河北某奶牛养殖场的50份污水样品,分别采用免疫荧光分析法(IFA)和IMS-qPCR检测,并比较分析检测结果。结果磁珠与Cp23单克隆抗体的最佳孵育浓度为20 ng/ml,最佳孵育时间为30 min,最佳捕获时间为30 min,卵囊的回收率>95%。PCR扩增产物长度为272 bp,重组质粒经酶切和测序鉴定正确。荧光探针定量PCR结果显示,重组质粒拷贝数与Ct值之间呈现良好的线性关系,相关系数r2=0.996 1。特异性和敏感性检测结果显示,仅微小隐孢子虫有扩增条带,最低10 copy/μl微小隐孢子虫卵囊18S rDNA重组质粒可被检测到。以IFA检测结果为金标准,50份水样的检测结果显示,IMS-qPCR的特异性为100%(18/18),敏感性为93.8%(30/32)。结论 IMS-qPCR可用于检测水源性微小隐孢子虫卵囊。