摘要：为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。

摘要：全生命周期管理是指对管理对象生命周期的全过程实行一体化动态管理的行为。本文结合农业科研事业单位的固定资产管理经验,分析了前期购置、中期使用、后期处置等环节产生的问题,总结出固定资产管理存在的问题主要是由“信息孤岛”现象造成的,依托信息化手段构建科研单位固定资产全生命周期管理系统是资产管理工作的实践需求。本文尝试将全生命周期理念融入固定资产管理的设计中,从而提出可以解决实际问题的一些思考。

摘要：信息不对称会带来逆向选择和道德风险。本文结合农业科研事业单位的基建项目管理经验,分析了项目申报阶段组织者和使用方、项目实施阶段组织者和使用方、项目实施阶段建设单位与参建各方等之间的信息不对称情形和内在原因,最后从建设基建项目管理数据平台、设计合理的契约合同、建立督查和惩罚机制等方面提出解决和消解基建项目过程管理中信息不对称问题的对策。

摘要：从患暴发性死亡的斑鳢病灶中分离出一株弹状病毒。取病鱼肝、脾、肾组织过滤液接种EPC、FHM细胞,连续传至第3代后28℃培养35h出现细胞病变(CPE),测得病毒半数细胞感染量为10 5.746/0.1 mL。将病变细胞制成超薄切片,透射电镜下观察到细胞质中存在大量呈子弹状的病毒颗粒,大小约53 nm×140 nm。用上述组织过滤液及F3代细胞培养病毒液回归感染健康斑鳢均能显示与自然发病鱼相似的症状,死亡率达100%。根据鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)N蛋白保守序列设计的引物对斑鳢病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增,得到大小约400 bp的阳性片段。对该片段克隆、测序后与GenBank中序列进行BLAST比对,发现该基因序列与SCRV同源性最高,为94%。选取GenBank中已登录的病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鳢弹状病毒(SHRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、狂犬病毒(RV)、牙鲆弹状病毒(HIRRV)相关序列构建系统进化树,结果表明,该基因序列与SCRV聚为一支。由于该病毒粒子的形态大小与SCRV(100 nm×200 nm)存在一定差异,暂将其命名为斑鳢弹状病毒(CHRV)。

摘要：研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio,CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF57进行RNA干扰,以探究其对CyHV-2病毒复制的影响。首先,以FAM标记的异育银鲫β-actin的siRNA进行CSC细胞转染条件的优化,再将针对CyHV-2 ORF57基因设计的3条siRNA,转染CSC细胞,并进行病毒感染,评估siRNA对病毒复制和致细胞病变的影响。转染条件优化结果显示,在siRNA浓度为80 nmol/L,转染液维持24h后更换维持液,β-actin基因表达量最低且观察到的荧光点数量最多。而ORF57-siRNAs干扰结果显示,ORF57-siRNA-2组表现出了较强的抑制效果,在接毒48h时,ORF57-siRNA-2处理组的ORF57基因表达量降到相对于Mock组的33.55%(P<0.01),并且各ORF57-siRNA组都表现出了延缓CyHV-2致细胞病变的时间和强度,抑制时间可达120h。TCID_(50)结果显示,不同组的ORF57-siRNAs均能降低病毒滴度,其中ORF57-siRNA-2将病毒原液TCID_(50)108.487/mL下降至106.776/mL。研究结果表明,干扰ORF57的表达可大大降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率,ORF57在CyHV-2复制与致细胞病变中起重要作用。本研究为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和弱毒株的改造提供了借鉴。

摘要：重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术。RPA引物探针设计要求简单,能在31℃-42℃的温度实现扩增,利用重组酶与引物结合并寻找与引物互补的同源序列,解锁局部双链DNA,不需要对模板高温变性,20-30分钟可获得大量扩增产物。

摘要：为了开发云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交尖塘鳢种间特异性分子标记,选择泛素化相互作用基序包含蛋白1(sumo-interacting motif-containing protein 1,simc1)基因作为候选基因。利用该基因mRNA序列设计引物对P1针对3种尖塘鳢基因组进行扩增,均扩增到893 bp的外显子序列。该序列在3种尖塘鳢种内个体间均未获得单核苷酸多态性(singe nucleotide polymorphisms,SNP)位点,但种间共存在21个SNP位点,其中有7个同义突变,14个错义突变。选择较容易设计引物的SNP15位点设计等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)引物对P2和P3。利用这两对引物针对待测样品基因组进行扩增,若P2扩增出222 bp条带,而P3无扩增条带,则样品为线纹尖塘鳢;若P2无扩增条带,而P3扩增出566 bp条带,则为云斑尖塘鳢;若P2和P3同时扩增出222 bp和566 bp条带,则为杂交尖塘鳢。通过对模板进行梯度稀释,检测P2和P3引物对灵敏度,结果表明,P2引物对检测的基因组最低浓度为5×10^(-4)mg/L,P3引物对检测的基因组最低浓度为5×10^(-2)mg/L。3种尖塘鳢特异性SNP标记的开发及快速检测方法的建立,可为尖塘鳢种质资源鉴定及新品种培育等工作提供技术支撑。

摘要：为了探究曝气流量与曝气管长度对增氧性能的影响，在不同曝气流量、不同曝气管长度条件下进行了室内水体底部微孔曝气增氧试验。分析了曝气流量与曝气管长度对氧体积传质系数、增氧量和氧利用率的影响。研究结果表明，当曝气流量为0.27～0.55 m3/s、曝气管长为0.9～1.5 m时，所对应的氧体积传质系数在0.63～1.1 h-1变化，增氧量在6.8～12.9 g/h变化，氧利用率在6.87%～9.28%变化，且在一定的曝气管长度下，氧体积传质系数、增氧量均与曝气流量成正比，而氧利用率则与其成反比关系；在一定的曝气流量下，曝气管长度对氧体积传质系数产生的影响表现为先高后低再高的趋势；氧体积传质系数与修正的饱和溶解氧浓度是否作为增氧量的主要影响因子取决于曝气管长度；曝气流量对氧利用率较曝气管长度更为敏感。研究还发现，微孔曝气系统中存在着最优曝气管长度，使得增氧性能最佳，并建立了最优曝气管长度与曝气流量、水深、输入压力、最优初始气泡直径的相关关系式，为低碳经济下微孔曝气系统的设计和运行提供了理论依据。

摘要：参考对虾溶菌酶基因和类溶菌酶基因及其他多种生物的溶菌酶基因序列 ,设计并合成引物。运用RT PCR技术 ,从斑节对虾血细胞总RNA中扩增获得特异性片段。所获片段回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明 ,所克隆的斑节对虾溶菌酶基因片段长 6 5 8bp ,包括溶菌酶基因开放阅读框 (ORF)4 77bp和 3′端非编码区的 181bp。 4 77bpORF共编码 15 8个氨基酸 ,包括溶菌酶成熟肽 14 0个氨基酸残基和信号肽 18个氨基酸残基。斑节对虾溶菌酶成熟肽推测分子量为 16 ,32kd ,等电点为 8 78。与南美白对虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列比较 ,同源性分别为 89 5 %和 93 0 % ;与日本对虾类溶菌酶基因的同源性分别为 84 0 %和91 0 %。进一步的序列分析表明 ,斑节对虾溶菌酶氨基酸序列与多种类群生物的c 型溶菌酶氨基酸序列具有较高的同源性 ,并具有与c 型溶菌酶相同的活性位点氨基酸残基Glu51和Asp68,且与活性位点相邻的序列高度保守。斑节对虾溶菌酶氨基酸序列还具有与c 型溶菌酶相同的结构氨基酸——— 8个半胱氨酸残基。因而可认为所克隆的斑节对虾溶菌酶基因属c 型溶菌酶基因。

摘要：【目的】克隆大口黑鲈(Micropterus salmoides)干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)基因,命名为MsIRF3,探究该基因在大口黑鲈先天性免疫防御中的重要作用。【方法】根据大口黑鲈基因组中IRF3基因序列设计引物,克隆MsIRF3基因;用生物信息学方法分析MsIRF3的结构特征和理化性质;用鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)或维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)感染大口黑鲈,并用病原类似物脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]刺激大口黑鲈头肾白细胞,采用荧光定量PCR方法检测MsIRF3基因表达量的动态变化。【结果】MsIRF3的ORF全长为1404 bp,编码467个氨基酸。MsIRF3包含DNA结合结构域(DBD)、IRF关联结构域(IAD)及丝氨酸结构域(SRD)等3个典型结构域。同源性分析表明,MsIRF3与斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF3的亲缘性最近。qRT-PCR分析表明,MsIRF3在健康大口黑鲈各组织中广泛表达,在肠和鳃中表达量相对较高(P<0.05)。鰤诺卡氏菌或维氏气单胞菌感染后,MsIRF3在肝脏、头肾和脾中表达量均上调(P<0.01)。LPS、LTA和Poly(I:C)刺激后,大口黑鲈头肾白细胞中MsIRF3均被诱导表达。【结论】MsIRF3基因在大口黑鲈防御病原体感染的免疫应答中发挥重要作用。