摘要：目的克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr70000热休克蛋白(CaHSP70)的部分编码基因。方法依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-CaHSP70,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白(简称为rCaHSP70)。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定。采用相关生物信息学软件对序列进行分析。结果根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组蛋白(rCaHSP70)Mr约为43000(含6个组氨酸),以包涵体的形式存在,可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别。rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇。种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近。ELISA检测结果表明,rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前。结论XZ-BOVHSP70部分编码基因的克隆获得成功,研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性。

摘要：目的建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法,用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。方法依据各基因参考序列,运用Primer Premier 5.0和Oligo6.0软件,设计5对特异性引物,采用Hot Start Taq DNA聚合酶,设置递增延伸温度,对恶性疟原虫标准株(3D7、Dd2和HB3)、分离株(FCC1/HN、CMH/YN)、现场标本(来源于海南、云南和缅甸)、近缘虫种对照(间日疟原虫、伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫)和空白对照(以H2O为模板)进行5个抗药性相关基因(包括恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、多药抗性基因Pfmdr1、二氢喋酸合成酶基因Pfdhps、二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6)的单管多重PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果,测定扩增产物序列,并与参考序列(3D7株)比对。结果经电泳,恶性疟原虫标准株、分离株和现场标本的多重PCR扩增产物均可见5条目标条带。测序结果与参考序列比对,高度同源,最低同源性为98.5%。模板DNA量达0.1ng即满足扩增要求,近缘虫种对照和空白对照未见扩增产物。结论多重PCR技术实现了单管1次反应完成5个抗药性相关基因的扩增,该方法灵敏,特异性好,有助于提高恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。

摘要：目的建立一种多重PCR方法检测小管福寿螺体内的广州管圆线虫幼虫。方法根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列(GenBank登录号为AY295804)设计特异性引物,并与小管福寿螺16srDNA的特异性引物组合,建立多重PCR检测方法。分别以阳性和阴性小管福寿螺DNA为模板进行多重PCR扩增,电泳鉴定并测序。用阴性小管福寿螺DNA倍比稀释200条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA模板,使之浓度分别为1200ng/μl、120ng/μl、12ng/μl、1200pg/μl、120pg/μl和12pg/μl,检测该方法的敏感性。野外采集小管福寿螺172只,肺检法检测后,进行多重PCR扩增,计算敏感性和特异性。结果电泳和测序结果证实该多重PCR检测方法能有效扩增出目的片段,小管福寿螺和广州管圆线虫的目的片段分别为550和405bp。该方法可检测出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA的最小浓度为120pg/μl。肺检法和多重PCR法检测均为阳性结果的45只,两法均为阴性的100只。肺检法为阴性、多重PCR法为阳性的24只,肺检法为阳性而多重PCR法检测为阴性的3只。多重PCR的敏感性和特异性分别为93.8%(45/48)和80.6%(100/124)。多重PCR法的阳性检出率为40.1%(69/172),肺检法阳性检出率为27.9%(48/172),差异具有统计学意义(χ2=14.8,P<0.01)。结论建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法。

摘要：目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较。方法微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析。Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性。结果3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊。结论3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测。

摘要：目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。

摘要：目的 应用新建的多重PCR体系检测4种人体疟原虫。 方法 应用DNAman软件比较分析4种人体疟原虫的18S rDNA基因序列，采用Oligo 6.0软件，在其第5和第6保守区间的变异区设计4条下游引物序列，并以含4种疟原虫18S rDNA部分序列的质粒DNA为模板，检测多重PCR体系的特异性和敏感性。此外，将新建的多重PCR体系与NP-1993体系的第1轮属特异引物组合，形成新的巢式PCR扩增体系（M-Nest体系），并用该体系和新建的多重PCR体系对不同稀释倍数的恶性疟和间日疟患者血样DNA进行扩增，检测这两种体系的敏感性。应用M-Nest体系和NP-1993体系检测广西2013年自加纳疟疾高流行区返乡人员的307份血样，比较两者的检测结果是否一致。最后，应用M-Nest和NP-2002体系对广西2014年1～5月份报告的66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样进行复核，比较两者的检测结果是否一致。 结果 应用新建的多重PCR体系得到的恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的扩增片段大小分别为268、446、394和323 bp，且不同原虫的扩增条带恰好位于50 bp DNA标志物条带之间，更易于区分，但不同疟原虫的Tm值较为接近，不易区分和鉴别虫种。新建体系对4种疟原虫18S rDNA基因的最低检出浓度分别为：恶性疟原虫5.58×102 拷贝/μl，三日疟原虫1.56×103 拷贝/μl，卵形疟原虫1.66×103 拷贝/μl，间日疟原虫1.80×102 拷贝/μl。新建体系对恶性疟原虫血样的最低检测浓度为1.43×102～8.84×103 拷贝/μl或5.10×10～4.92×102个原虫/μl，高于间日疟原虫的17.4～69.1 拷贝/μl和13.5～83.2个原虫/μl。与单独的多重PCR体系相比，应用M-Nest检测体系将对疟原虫的最低检测浓度降低了10～100倍。M-Nest体系和NP-1993体系对从加纳返乡的307份血样的检测结果不一致，并且M-Nest体系还检测到2例卵形疟原虫感染，而NP-1993体系则未能检测到该感染。此外，M-Nest体系和NP-2002体系对66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样的复核结果一致。 结论 新建的多重PCR检测体系可同时检测4种人体疟原虫，具有良好的现场适用性。

摘要：目的分离和鉴定采自徐州自然感染奶牛粪便中的隐孢子虫卵囊。方法在徐州某奶牛场采集经改良抗酸染色镜检确认为隐孢子虫感染的奶牛粪便,用不连续Sheather’s蔗糖密度梯度离心法纯化卵囊。采用Chelex-100方法提取卵囊基因组DNA,设计引物扩增小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因和卵囊囊壁蛋白(COWP)基因,分别克隆到pGEM-T和pGEM-T Easy载体,测定核苷酸序列,运用BLAST和MEGA软件进行序列同源性和种系发生分析。结果分离的隐孢子虫卵囊个体大小为(7．4±0．32)μm×(5．4±0．21)μm,长宽比为1．3±0．07(n=20)。徐州牛源隐孢子虫与Gen- Bank公布的安氏隐孢子虫比较,SSU rRNA和COWP基因序列同源性分别为100％和99％。种系发生分析显示该株隐孢子虫与安氏隐孢子虫处于同一分支。结论由徐州自然感染奶牛粪便中分离获得的隐孢子虫是安氏隐孢子虫。

摘要：目的建立敏感、特异、高效的检测田鼠巴贝虫FTA-环介导等温扩增技术(LAMP)。方法根据GenBank公布的田鼠巴贝虫基因序列,就细胞色素B基因保守序列设计了多套LAMP引物,利用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320仪筛选最佳引物、反应条件,建立LAMP检测方法,从保存有血液样本的FTA卡片中提取田鼠巴贝虫DNA进行LAMP,观察检测效果。结果设计的4组引物做LAMP试验,其中以引物1,最佳反应温度为64℃,恒温下作用,敏感性高,可在1h内完成,其检出限量为0.687fg/μL,而PCR的最低检测量为0.687pg/μL,与间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、冈地弓形虫、利什曼原虫、冈比亚锥虫均无交叉反应。以建立的FTA-LAMP法检测20份PCR检测阳性的田鼠巴贝虫感染者血样,其阳性符合率100%。结论成功建立了检测田鼠巴贝虫特异性细胞色素B基因的FTA-LAMP方法,该法特异性强、灵敏度高、简便、快速、适于现场应用。

摘要：目的建立一种简便、快速的FTA-巢式PCR方法用于鉴定粪便中溶组织内阿米巴原虫(Entamoeba histolytica,E.h)。方法收集门诊腹泻病人新鲜粪便,用光学显微镜进行初步检查。用FTA卡抽提镜检结果为阳性的粪便DNA,根据溶组织内阿米巴原虫的SSU-rRNA序列设计引物,进行巢式PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶分析,并对阳性产物进行测序和序列比对分析。结果根据光学显微镜检测结果,挑选了44例镜检结果为阿米巴原虫阳性的腹泻病人粪便。经FTA-巢式PCR扩增,其中20例样本可扩增出427bp左右的目的条带,目的条带的测序和序列分析结果表明为溶组织内阿米巴原虫。镜检方法与巢式PCR方法的阳性符合率为45.45%(20/44),将E.h与形态学相似的其他内阿米巴原虫进行了鉴定和区分。结论本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有简单、快速、准确等优点,为临床检验和流行病学调查中E.h的鉴别诊断提供了新的技术方法。

摘要：目的了解我国云南和海南恶性疟原虫分离株Pfcrt基因72-76位点基因型,并分析该位置不同基因型与恶性疟原虫对氯喹敏感性的关系。方法从我国恶性疟流行区云南和海南省采集恶性疟现症患者血样,根据恶性疟原虫Pfcrt基因序列设计引物,进行巢式PCR扩增和测序。采用WHO制定的体外微量法测定同批血样中恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果云南、海南省恶性疟原虫Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸单元型在氯喹敏感株均为CVMNK。其中海南的氯喹抗性株Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸为单一的CVIET单元型,云南氯喹抗性株中除一株为CVIKT,另1株为SVMNT外,均为CVIET单元型。结论我国云南、海南省恶性疟原虫氯喹敏感株Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸基因型为CVMNK。抗性株主要为CVIET型,Pfcrt基因第72-76位编码氨基酸基因型可作为氯喹抗性分子标志。