摘要：目的研究中国主要流行的HIV-1 C／B’重组毒株和B’亚型毒株感染者Nef特异性T细胞反应特征，确定两种亚型感染者共同识别的免疫优势区。方法本研究以59名HIV-1 C／B’重组毒株、27名B’亚型毒株感染者为研究对象，用ELISPOT检测针对HIV-1型C／B’Nef重叠多肽产生IFN-γ的特异性T细胞反应。结果44例（74．58％）HIV-1 C／B’重组毒株感染者产生Nef特异性T细胞反应，主要识别EVA7081．1、5、6、7、43、44、45、47、48、49这10条多肽，氨基酸序列为Nef63～115和117～139的区域。20例（74．07％）的HIV-1 B’毒株感染者产生Nef特异性T细胞反应，主要识别EVA7081．1、2、43、49这4条多肽，氨基酸序列为Nef63～77和87～119的区域。两种亚型感染者特异性T细胞反应的强度和广度与病毒载量和CD4细胞数不相关。结论中国HIV-1 C／B’重组毒株和B’亚型毒株感染者共同识别氨基酸序列为Nef63—77和87～115的免疫优势区，提示此区域可用于疫苗的设计．

摘要：目的建立实时定量PCR检测血浆病毒载量的方法,对马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)强毒株攻毒马和疫苗免疫攻毒马血浆中病毒载量进行了跟踪检测,探讨病毒载量和临床疾病状态的相关性.方法以EIAV强毒株LN40序列为标准,在gag保守区设计1对引物和Taqman探针,用于实时定量PCR扩增,用含扩增目的基因的体外转录RNA作标准品,获得标准曲线,对扩增样品进行准确定量.强毒株LN40直接攻毒,或者疫苗株DLV免疫马6个月后用强毒株LN40进行攻毒,跟踪检测攻毒马及免疫攻毒马血浆中EIAV载量情况.结果反应在101～109copies/ml之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10 copies/ml.强毒攻毒马出现发热并最终死亡,发热期间马血浆中EIAV载量与体温呈正相关,载量最高达107 copies/ml.免疫攻毒马未出现发热,其血浆EIAV载量的总体水平低于强毒攻毒马,攻毒后3个月低至10 copies/ml以下.结论成功建立了实时定量PCR检测血浆EIAV载量的方法,并证实了用实时荧光定量PCR检测EIAV病毒载量的方法来监测动物感染状态具有可行性,为EIAV致病机制研究和弱毒疫苗免疫保护机制的研究提供良好的技术平台.

摘要：目的　建立一套新的亚型鉴定方法 ,仅仅使用巢式PCR ,一次扩增 ,即可对我国HIV 1主要流行株B、C和CRF0 1 AE进行亚型鉴定。方法　从HIV阳性样本中提取核酸 ,使用能覆盖HIV 1型M组gag区的引物进行第一轮扩增 ,第二轮扩增则使用分别检测B、C、CRF0 1 AE亚型的三套特异性引物进行扩增 ,三套引物放在同一个反应管中。反应产物经琼脂糖电泳后观察 ,不同亚型的位置不同 ,以此来判断亚型。另外设计一套引物 ,专门检测我国重组株CRF0 7 BC和CRF0 8 BC。所有样品均经过基因测序、系统进化树分析 ,以进行结果验证。结果　在检测的 119份样品中 ,经基因测序和系统进化树分析证实B亚型样品 4 3份 (欧美B 11份 ,泰国B 32份 ) ,C、CRF0 1 AE、A和D亚型样品分别为 5 4份、17份、3份和 2份。其中C亚型的样品 ,有 5 2份属于CRF0 7 BC和CRF0 8 BC。而经过上述多重巢式PCR方法检测到的B亚型样品为 35份 (81 4 % ) ,C亚型 4 6份 (85 2 % )和CRF0 1 AE 13份(76 5 % )。另外 ,检测CRF0 7 BC和CRF0 8 BC重组株的引物特异性地检测到 4 3份 (82 7% )样品。上述结果与基因分析结果吻合 ,各个亚型之间无交叉 ,一种亚型的特异性引物只对该亚型有反应 ,而对其他亚型无反应 ,特异性达到 10 0 %。虽然有时会有非特异扩增带 。

摘要：目的构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)分子探针,对新型冠状病毒感染康复者(简称“新冠康复者”)的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行单克隆记忆B细胞分选,获得RBD特异性中和抗体。方法从GenBank中下载SARS-CoV-2 RBD序列,在C末端加入Avi标签和6组氨酸标签后进行密码子优化设计、合成基因后克隆入表达载体pDRVI1.0,转染293F表达出蛋白进行生物素化后,利用该探针从2名新冠康复者的PBMCs中分选出单克隆RBD特异性B细胞。对B细胞裂解后,进行抗体轻重链可变区扩增,将获得的抗体轻重链基因分别克隆入表达载体,转染293F细胞后采用Protein A对抗体进行纯化,并利用SARS-CoV-2假病毒对其中和能力进行测试。结果成功获得了RBD-Avi蛋白,RBD-Avi探针生物素化效率达到30%~50%,Western Blot实验证实生物素化探针可以被来自于新冠康复者血浆中的抗体所识别,利用该探针可从2名新冠康复者体内成功分别分离出7个、16个RBD特异性记忆B细胞,分别占总细胞群的0.24%和0.17%;对获得的B细胞进行裂解后扩增出抗体的轻重链可变区,分别获得了7对、12对抗体轻重链。2名新冠康复者体内共表达出16个抗体,纯化抗体后利用SARS-CoV-2假病毒进行测试,大部分抗体对假病毒都展示出了中和活性,其中6个抗体的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)低于1μg/mL;XJ-A9和SCF-F1针对野生型假病毒的IC50值分别达到0.07μg/mL和0.35μg/mL。结论本研究构建的SARS-CoV-2 RBD分子探针具有良好的抗原性,分离的抗体具有针对SARS-CoV-2野生型假病毒的中和活性,具备深入研究的价值。