摘要：本研究构建了表达甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)融合蛋白的原核表达载体,根据铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)核苷酸序列设计突变PCR引物并实施突变PCR,以获得PEA基因编码区第553位氨基酸密码子缺失的突变PEA(ntPE),从而产生无毒性的PEA突变基因,然后用合成的M2e编码区替换ntPE基因中的非必需区Ib,产生ntPE-M2e嵌合基因。将该嵌合基因导入pET表达载体以构建原核表达载体,将表达产物胶回收后与弗氏不完全佐剂联合皮下免疫BALB/c小鼠,终免两周后用5个LD50流感病毒A/PR/34/8株进行攻击。取动物血清作ELISA并取脾脏作ELISPOT试验结果表明,免疫组可以诱导小鼠产生抗M2e特异性抗体反应和细胞免疫反应并能够抑制病毒在肺内的复制。本研究为甲型流感病毒广谱疫苗的进一步研发打下了基础。

摘要：目的通过建立RNA干扰(RNAinterference,RNAi)抑制XJ160病毒复制的模型,在序列特异性、位置效应和量效关系等方面,探讨RNAi对XJ160病毒复制的影响,为进一步研究RNAi的抗病毒作用和机制奠定基础。方法按照siRNA(shortinterferencingRNA)的设计要求合成XJ160病毒特异siRNA,脂质体法转染BHK21细胞后感染XJ160病毒,通过测定病毒滴度、蛋白表达量及XJ160病毒RNA合成研究siRNA对XJ160病毒复制的抑制。结果成功建立了RNAi抑制XJ160病毒复制的模型,探讨了RNAi抑制该病毒复制作用的特点。结论外源导入的siRNA能够抑制XJ160病毒的复制,并且这种抑制作用具有明显的序列特异性、位置效应和存在量效关系等特点;siRNA是通过降解病毒RNA实现抑制病毒复制作用的。

摘要：目的在大肠埃希菌中高效表达重组人干扰素λ2(rhIFNλ2),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌的偏爱密码子人工设计合成人干扰素λ2(hIFNλ2)的高表达基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌中进行表达,表达产物经变性、复性、阳离子交换层析及分子筛层析纯化,测定其抗病毒活性、种属特异性及抗HBV活性。结果在大肠埃希菌表达的目的蛋白占细胞总蛋白量的15%左右,纯化后的纯度达到90%以上,在WISH细胞上抗VSV活性约为1.5×106IU/mg。与rhIFNα2b比较,表达产物在非灵长类细胞上的抗病毒活性较在灵长类细胞上弱,目的蛋白在HepG2.2.15细胞上表现有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性。结论hIFNλ2可以在大肠埃希菌内实现高效表达,表达产物具有抗病毒活性,有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性,本型IFN有较严格的种属特异性。

摘要：本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT—PCR检测方法，该方法可以同时检测12种呼吸道病毒，包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物，分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10^3拷贝／μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本，以realtime RT—PCR为参考标准，进一步验证检测体系。结果表明，这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强，可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。

摘要：本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。

摘要：为了获得人干扰素 ω(huIFN ω)在大肠杆菌中的高效表达,根据大肠杆菌的偏爱密码子,人工设计并合成了huIFN ω高表达基因,并克隆到原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的15%左右,以包涵体形式存在。表达产物经变性、复性及阳离子和分子筛层析纯化,纯度达90%以上,产物的抗病毒活性约为1.0×108IU/mg,并具有体外促NK杀伤活性。此结果为进一步研究和开发重组huIFN ω奠定了基础。

摘要：建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导等温核酸扩增技术(LAMP)应用于HPV6和HPV16亚型的检测。该技术设计分别对应于HPV6和16的E6和E7基因序列中6个区段的4条特异引物,在等温条件下(63℃)进行核酸扩增反应1h,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色的变化做为结果判定的标准,并经LA-320实时浊度仪和琼脂糖电泳证实。文中利用这种技术对13份已知的单重感染13种HPV不同亚型的临床样本进行了特异性分析,同时对2个含目的片段的克隆质粒的系列稀释物进行了灵敏度分析。结果显示LAMP方法特异性高,颜色法判断的灵敏度均为1000个拷贝DNA分子水平,比Real-time PCR低10～20倍,对62份宫颈刮片临床标本的HPV6和HPV16检出率和HPV分型试剂盒一致。因此,基于颜色判定的环介导等温扩增方法有望应用于人乳头瘤病毒HPV6和HPV16感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心和医院推广和应用的潜力。

摘要：目的建立一种基于GenomeLab^TM GeXP（GenomeLab eXpress Profiling）遗传分析系统的人乳头瘤病毒（HPV）分型新技术。方法针对5种中国人常见的HPV亚型（HPV6，11，31，33和52）的基因序列进行比对分析，设计型特异性引物，建立并优化GeXP多重PCR反应体系，评价其特异性和灵敏性，并应用于30份临床标本检测。结果本研究建立的GeXP多重PCR技术能够成功检测和鉴别5种不同亚型的HPV病毒，灵敏度高，特异性好。结论成功建立了一种新的快速同时检测和鉴别5种HPV亚型病毒的多重PCR方法，适用于临床HPV感染的实验室诊断与流行病学研究。

摘要：目的 建立一种基于多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的多种流感病毒核酸快速检测方法.方法 对5种亚型流感病毒的HA基因序列进行比对分析,选择合适的保守区域设计引物序列,并在扩增产物序列内部选择高变区设计探针序列.首先,使用生物素标记的引物扩增出同样带标记的PCR产物;然后,产物与膜上的探针杂交,通过生物素-亲和素反应,最后以斑点显色的方式来检测和鉴别不同亚型的流感病毒.实验中还通过摸索不同的引物浓度和探针浓度来优化反应条件.结果 成功建立了一种基于多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的检测方法,该方法能够成功检测和鉴别5种不同亚型的流感病毒,检测灵敏度比传统的RT-PCR方法高100～1000倍.结论 成功建立了一种可高通量快速检测多种流感病毒的多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的检测方法.

摘要：目的以CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA重组质粒（pCTN-GFP）和HEP-Flury株病毒N、P、L辅助质粒共转染拯救具有活性的CTN株重组狂犬病病毒（CTN-GFP）。方法将CTN株狂犬病病毒全长基因组分4段进行扩增，体外连接扩增片段并克隆人表达载体中，构建CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA重组质粒，基因组ψ基因被标识基因GFP取代，通过与HEP-Flury株病毒N、P、L3个辅助质粒共转染BHK-21细胞，拯救能够稳定表达GFP的重组病毒CTN-GFP。结果成功扩增全长基因组的4个基因片段，并将其克隆入表达载体，构建了CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA重组质粒pCTN-GFP，经酶切鉴定和序列测定证明pCTN-GFP为正确克隆，可直接用于病毒拯救。将pCTN-GFP与HEP-Flury株病毒辅助质粒共转染BHK-21细胞4d后，成功拯救出CTN株重组狂犬病病毒，重组病毒能够表达标识基因GFP，荧光显微镜下可直接观察到标识基因GFP的表达，设计跨GFP和L基因的特性引物对重组病毒进行RT-PCR检测，结果证明此病毒是从克隆的质粒中拯救的重组病毒。结论HEP-Flury株病毒的结构蛋白能够包装并转录CTN株病毒的基因组RNA。