摘要：RNA干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi途径的重要中介, 已被广泛应用于动、植物抗病毒治疗研究。本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因为靶位,设计合成表达小干扰RNA的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121中,直接转化根癌农杆菌。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了同源于TMV外壳蛋白的siRNA对TMV侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的siRNA能够特异性干扰TMV侵染。含有重组表达载体pBI121／siRNA的根癌农杆菌渗入普通烟植株,在TMV接种后14 d其上部叶片没有表现典型的花叶症状。对这些叶片进行Northern杂交试验也没有检测到TMV病毒的RNA积累或仅有很少量的积累。在枯斑寄主心叶烟上,siRNA的瞬时表达可使TMV侵染后的枯斑数明显减少,甚至不产生枯斑。此外,同源于TMV外壳蛋白的siRNA瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)没有抑制作用,表明siRNA的干扰作用具有高度的同源依赖性。

摘要：在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中,都需要使用寡核苷酸作为探针或引物,而对这些反应的质量起最重要影响作用的,就是这些寡核苷酸探针或引物.用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果,而用不够合适的寡核苷酸时,常常得出似是而非的结果,不仅大大增加了后续实验的工作量,还可能一无所获.

摘要：构建了两个表达斑马鱼cdk7(基因片段)和cyclinH(基因全长)的重组质粒,分别转化大肠杆菌BL21进行原核表达,所得的CDK7和cyclinH两个融合蛋白均以包涵体形式存在。经SDS-PAGE分离,切下含有目的蛋白条带的凝胶冻成干粉,分别免疫新西兰大耳兔,制备并纯化了分别抗CDK7和抗cyclinH的两个多克隆抗体。经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析检测,确定获得了两种具有较高效价的特异性多克隆抗体。免疫荧光组织化学结果显示,CDK7和cyclinH这两个蛋白质均普遍存在于斑马鱼胚胎动物极的各个细胞中。

摘要：目的 :构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂 1 (tissue inhibitor of m etalloproteinases1 ,TIMP- 1 )的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定 ,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础。方法 :设计并合成针对人组织 TIMP- 1 m RNA的锤头状核酶基因 Rz1 82、Rz35 8和 Rz4 1 2及相应的点突变核酶基因 ,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体 p BSK-neo U 6中 ,制备嵌合于 U 6 sn RNA分子的核酶基因克隆。逆转录聚合酶链式反应获得全长 TIMP- 1 m RNA基因片段并克隆至T载体。体外转录法大量制备以 α- 32 P U TP标记的核酶及靶 RNA,进行体外切割实验。 结果 :核酶基因克隆制备正确 ,在体外成功转录出嵌合于 U6 sn RNA的核酶和靶 RNA。 37℃的生理温度下 ,U6 Rz1 82和 U6 Rz35 8成功切割了靶 RNA,U6 Rz1 82切割效率为 4 9.2 3% ,Km=2 9.7nmol/ L ,Kcat=0 .32 m in- 1 。 U 6 Rz35 8切割效率为 5 5 .2 1 %。 Km=39.6 nm ol/ L ,Kcat=0 .2 1min- 1。U6 Rz4 1 2及突变核酶均未显示切割活性。结论 :本研究中制备的 U6 Rz1 82和 U6 Rz35 8有良好的特异催化切割活性 ,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人 TIMP- 1的表达 。

摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象．目前介导RNAi的方法很多,包括采用非病毒性和病毒性载体介导．最近研究发现,以病毒为载体介导RNAi具有显著的优越性．病毒载体通过表达70 bp左右的发夹结构RNA(shRNA),在Dicer酶的催化作用下,切割成21 bp左右的双链小分子干扰RNA(siRNA),从而有效沉默靶向基因．运用RNAi技术可设计一系列有效的抗癌策略,如沉默癌基因、促进调亡、调控细胞周期、抗血管生成以及提高传统化疗、放疗的疗效等．这一技术开辟了肿瘤基因治疗的新途径．本文就RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用与研究作一评述．

摘要：大量研究表明转化生长因子β1参与细胞的多种生理和病理过程.为了研究TGFβ1在这些过程中的详细发病机制,设计了针对TGFβ1的非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶.鉴定非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶的胞外以及活化型肝星状细胞内的活性.核酶的胞外切割反应结果证实,非嵌合型核酶的胞外活性优于U1小核RNA嵌合型核酶.进一步研究发现,U1小核RNA嵌合型核酶在转染的肝星状细胞内可以高效下调TGFβ1的表达,且其胞内活性明显强于非嵌合型核酶.这些结果表明,抗TGFβ1的U1小核RNA嵌合型核酶不仅为TGFβ1在细胞的生理和病理过程中具体作用机制的研究提供一种有效的工具,而且有望为TGFβ1相关性疾病的治疗提供一个有效手段.

摘要：核酶发现至今已 2 2年了。 1989年的诺贝尔化学奖授于核酶的发现者S .Altman和T .Cech。至 2 0 0 4年 2月发表有 5 0 0 0多篇有关核酶的研究论文和综述。自然界留存的核酶不多 ,但已能制造出许许多多人工核酶。从 1997年人造出‘肽基转移核酶’到 2 0 0 0年根据一系列证据提出‘核糖体是一种核酶’ ,在理论上和应用上都具有深远意义。核酶出现早于酶 (蛋白质 ) ,后来让位于酶的观点 ,已为多数人所接受。在应用上 ,人们已经设计和制造出各种各样的核酶对付各种各样的疾病 。

摘要：拟通过RNA干扰技术特异下调人血红素加氧酶-1（human heme oxygenase-1，hHO-1）基因的表达，减少hHO-1的产量从而降低胆红素的产生，探讨在胆红素产生前就阻断其产生，为临床早期防治新生儿高胆红素血症及胆红素中毒性脑病探索一种新的有效手段。针对hHO-1基因设计并化学合成三对小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。采用脂质体转染法将siRNA转染入人肝脏细胞株HL-7702；荧光显微镜检测siRNA转染细胞的效率；转染siRNA1-2天后经RT—PCR和Western印迹方法检测hHO-1表达水平和蛋白质量；并采用HO-1诱导剂血红素诱导或hHO—1表达质粒转染细胞以上调hHO—1表达，检测siRNA干扰后hHO-1产量和酶活性。结果显示：设计的三对siRNA能不同程度的特异下调hHO-1表达，筛选获得抑制效果最佳的siRNA-3。siRNA-3抑制hHO—1呈现浓度与时间依赖性。与非特异对照siRNA及未处理组比较，血红素诱导和hHO-1表达质粒转染均能上调HL-7702细胞内hHO-1表达，提高hHO-1产量，但转染siRNA-3后hHO-1表达明显抑制，同时hHO-1活性随着基因表达下调而下降。实验表明设计合成的siRNA-3抑制效果明显。siRNA-3通过降解hHO—1，减少hHO-1产量，降低酶活性，最终减少胆红素产生，从而使RNA干扰技术成为降低新生儿高胆红素血症和胆红素中毒性脑病发生的一种候选方法。

摘要：氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)催化tRNA的氨基酰化反应,为生物体内蛋白质合成提供原料。许多aaRS为保持蛋白质翻译的精确性,在进化的选择压力下产生了编校功能。近年来,人们越来越多关注aaRS编校功能同人类健康之间的关系。在过去的几年中,对于aaRS编校功能缺陷在细胞内的生理效应,与疾病发生的关系和以编校活性位点作为药靶设计、开发新型抗生素的研究中取得了重要的进展。

摘要：目的:构建针对人BRMS1基因的RNA干扰表达载体并检测其有效性,为后续研究提供基础。方法:设计合成针对人BRMS1的特异性si RNA前体寡核苷酸,依次通过退火,连接,构建含前体si RNA的重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-BRMS1-si-RNA。经测序鉴定后,通过脂质体介导将其与pDsRed2-N1-BRMS1质粒(包含BRMS1红色荧光融合蛋白的载体)共转染人胚肾293细胞。分别用倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞中红色荧光蛋白的强度,检测干扰效果。结果:确定了两对针对人BRMS1的si RNA片段。经测序鉴定,两种含前体si RNA的质粒均构建成功。共转染后,倒置荧光显微镜下观察可见,两种si R-NA均能明显降低细胞中BRMS1的表达;用流式细胞仪检测证实,si RNA1及si RNA2分别使BRMS1表达下降67.33%和76.67%,与阴性对照组比较差异有统计学意义,P<0.05。结论:成功构建了针对人BRMS1基因的si RNA表达质粒,为进一步利用RNA干扰技术研究BRMS1功能与作用机制奠定了基础。