摘要：背景:肝移植手术容易导致致命性大出血,如何评估肝移植手术过程的出血、止血、凝血功能以及使用怎样的止血措施解决凝血问题,目前还没有常规止血指导方案。呼吸功能监测和呼吸道管理是肝移植后首先遇到的重要问题,因此呼吸机治疗和呼吸系统并发症的处理在ICU期间显得尤为重要。目的:回顾性分析肝移植手术中的出血特点以及出血/输血量对移植后呼吸功能恢复的影响。设计、时间及地点:回顾性病例分析,于2001-02/2006-09在中山大学附属第二医院肝胆外科完成。对象:资料完整的成人肝移植患者48例。根据病因将患者分为4组,单纯肝硬化组8例,肝硬化合并肝癌组32例,单纯肝癌不合并肝硬化组5例,急性炎症组3例。以出血量大于5000mL为界将患者分为2组,大量失血组9例,小量失血组39例。方法:了解不同病因患者移植手术中出血量对术后呼吸功能恢复的影响。回顾性分析手术各时期的出血量,包括切肝期,无肝期和新肝期,对各期的出血量进行统计分析,了解在肝移植手术过程中不同病因的患者手术不同时期出血的特点。主要观察指标:患者手术各时期的出血量,大量失血组及小量失血组手术后呼吸功能等恢复情况,围手术期并发症、死亡率。结果:病肝切除阶段是主要的出血时间段,以广泛渗血为主要特点。不同病因患者手术出血量明显不同,出血量最多为肝癌合并肝硬化、其他依次为肝硬化、急性重症肝炎及无肝硬化肝癌(P5000mL)明显影响患者移植后呼吸功能的恢复,并且造成较高的围手术期并发症发生率及死亡率(P<0.05)。结论:在肝移植手术中,尤其是对肝癌合并肝硬化实施肝移植手术,控制切肝时间相广泛渗血是手术中主要的防止出血手段;大量出血、输血可能造成患者移植后呼吸功能恢复延迟,并且造成较高的呼吸系统并发症发生率及死亡率。

摘要：目的探讨大鼠异体胰腺移植模型的手术操作方法,并对大鼠颈部胰段移植和腹部胰十二指肠移植模型的术式和特点进行比较。方法施行颈部胰段移植60次和腹部胰十二指肠移植模型60次,均采用显微外科缝合法进行动、静脉吻合。结果颈部和腹部异体胰腺移植的供体手术时间分别为(31．0±6．0)min和(37．6±3．8)min；受体手术时间分别为(49．2±5．6)min和(60．6±7．8)min。两组供体平均手术时间差异无统计学意义(P＞0．05)；腹部模型受体手术时间明显长于颈部模型(P＜0．05)。无干预同系移植组中,颈部和腹部异体胰腺移植术后1周存活率分别为93．6%和86．2%,两种术式的手术成功率差异无统计学意义(P＞0．05)。结论两种异体胰腺移植术式均可以满足胰腺移植免疫和生理研究的需要。两种术式分别有其各自的优缺点,术式选择主要根据实验者的设计进行。

摘要：目的构建表达人类白细胞抗原-G（HLA—G）基凶shRNA载体，探讨其对自然杀伤细胞（NK）细胞杀伤效应的影响。方法构建4个HLA—G—shRNA真核表达质粒，转染至Huh7细胞。检测HLA—GmRNA及蛋白质水平的表达。将NK-92MI细胞与靶细胞共同培养，以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果经酶切及测序鉴定证实，插入序列与设计的序列相符。RealTime—PCR和Western-blot结果均表明重组载体抑制了Huh7细胞HLA-G基因的表达。NK-92MI细胞对转染HLA—G的shRNA的Huh7细胞杀伤作用明显升高（P〈0．01）。封闭NK-92MI细胞ILT2受体后，杀伤作用降低（P〈0．01）。结论HLA—GshRNA可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。

摘要：背景:目前广泛应用于骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法,但标记与固定程序复杂,操作繁琐,易出现偏差。氯甲基苯甲酰氨(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Dil)是亲脂性膜荧光染料,能够与含有肽和蛋白质的硫氢基结合进而标记整个细胞。目的:探讨CM-Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性。设计、时间及地点:体内外细胞学观察,于2007-05/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成。材料:SPF级Wistar大鼠40只,由中山大学实验动物中心提供。CM-Dil为美国Sigma公司产品。方法:在体外,以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组,以未标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为对照组,比较两组细胞生长与增殖情况,MTT法检测细胞生长增殖情况。在体内,分别将标记CM-Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养,于移植后第7,15,21,30天制备肝脏切片。主要观察指标:骨髓间质干细胞CM-Dil标记率,标记细胞在肝内定植、生长与分布。结果:体外培养结果显示,两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似,在绿色光激发下,CM-Dil发出红色荧光,24h后细胞标记率为100%,21d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭。体内实验中,经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质,呈椭圆形或不规则形的分化细胞;肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈"贴壁生长",为椭圆形分化细胞,未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内;CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21d。结论:CM-Dil染色简单、方便、稳定,荧光开始淬灭时间较长,可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法。

摘要：目的:探讨肝癌Hep3B细胞白细胞抗原-G(HLA-G)过表达对NK细胞体外杀伤作用的影响。方法:实验分为正常对照组(无干预措施,Hep3B组)、空载体对照组(转染空质粒,Hep3B-GFP组)和实验组(转染pEGFP-C1-HLA-G质粒,Hep3B-HLA-G组)。构建HLA-G真核表达质粒,转染至Hep3B细胞,经G418筛选,建立稳定过表达HLA-G的肝癌Hep3B细胞。Real-time PCR及Western blotting检测肝癌Hep3B细胞HLA-G mRNA及蛋白质水平的表达。分析肝癌Hep3B细胞HLA-G过表达及HLA-ABC抗体封闭靶细胞相应位点对NK细胞体外杀伤作用的影响。结果:经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符。Real-time PCR和Western blotting结果均表明,转染重组质粒的Hep3B细胞HLA-G过表达(P<0.01)。NK细胞对转染pEGFP-C1-HLA-G的Hep3B细胞杀伤作用明显降低(P<0.01),HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对Hep3B、Hep3B-GFP和Hep3B HLA-G细胞的杀伤均增加(P<0.01)。结论:pEGFP-C1-HLA-G表达载体可有效增加HLA-G表达,HLA-G过表达可以削弱NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对靶细胞的杀伤能力普遍有所提高。

摘要：背景:目前肝纤维化尚没有公认的特效疗法,近年来骨髓间质干细胞应用于肝纤维化的治疗已取得一定效果,但具体机制仍不明确。目的:体外探讨人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的调控作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学第三附属医院中心实验室完成。材料:骨髓来源于青年健康志愿者髂骨,人肝星状细胞购自中山大学实验动物中心,人正常肝细胞系L-O2购自中山大学实验动物中心。方法:将分离提纯的人骨髓间质干细胞与肝星状细胞在6孔Transwell板上建立上下共培养体系,接种密度均为2×104cells/well。另设L-O2代替人骨髓间质干细胞作为阴性对照,单纯培养的肝星状细胞为空白对照,培养72h。主要观察指标:肝星状细胞形态及免疫细胞化学染色结果,流式细胞仪检测肝星状细胞凋亡情况,Westernblot法检测肝星状细胞活化标志α-肌动蛋白的表达。结果:倒置显微镜下活化的肝星状细胞呈扁平状,胞浆内缺乏脂肪滴,α-肌动蛋白位于肝星状细胞胞质内,呈高张力纤维状分布。与L-02+肝星状细胞组、单纯肝星状细胞组比较,骨髓间质干细胞+肝星状细胞共培养组的肝星状细胞凋亡率明显升高(P<0.05),α-肌动蛋白表达水平明显下调。结论:人骨髓间质干细胞可抑制肝星状细胞活化,促进其凋亡,这可能是骨髓间质干细胞抗肝纤维化的作用机制。

摘要：背景:解决肝移植排斥反应的惟一方法是诱导免疫耐受,而环孢素A对诱导鼠肝移植免疫耐受及T细胞都存在一定影响,可为各种免疫抑制剂的合理使用提供依据。目的:探讨环孢素A诱导肝移植后免疫耐受的可行性及方法,分析CD4+CD25+调节性T细胞在诱导耐受中的作用。设计、时间及地点:随机分组,动物实验观察,2007-01/2008-04在中山大学医学实验动物中心和深圳市第三人民医院肝病研究所完成。材料:健康LEW大鼠66只,BN大鼠78只,CD4、CD25抗体和Foxp3抗体(克隆号PCH101)由美国eBioscience公司生产,环孢素A针剂由北京诺华制药提供。方法:根据用药情况建立6组肝移植模型:同基因对照组:BN大鼠进行同种异体肝移植,移植后不用药。急性排斥组:LEW大鼠作为供体,BN大鼠作为受体,移植后不用药。环孢素A小、中、大剂量组:LEW大鼠作为供体,BN大鼠作为受体,移植后分别给予环孢素A1.0,1.5,2.0mg/(kg·d),疗程均为5d。环孢素A中剂量延期组:LEW大鼠作为供体,BN大鼠作为受体,移植后给予环孢素A1.5mg/(kg·d),疗程7d。除急性排斥组和环孢素A小剂量组各24只外,其他6只/组。主要观察指标:观察各组大鼠移植后生存时间及外周血变化,并检测急性排斥组和组肝、环孢素A小剂量组脾组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg的含量。结果:同基因对照组存活时间>100d,而不发生排斥反应。环孢素A小、中、大剂量组存活时间分别为(51.5±2.4),(53.6±3.6),(23.2±2.1)d,环孢素A中剂量延期组和急性排斥组分别为(57.8±7.2),(20.6±3.2)d,除同基因对照组外,各组间差异均有统计性意义(F=114.82,P0.05)。环孢素A小剂量组肝组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg的含量明显增加,且高于急性排斥组(P<0.05)。结论:小剂量环孢素A可以诱导免疫耐受,大剂量环孢素A突然停药会导致加速性排斥。CD4+CD25+Foxp3+Treg能促进移植肝受体的免疫耐受,但其增加只存在于移植的肝内,外周血、脾脏未见增加。

摘要：目的探讨基于贝叶斯网络建立进展期胆囊癌患者根治性切除术后生存预测模型的临床价值。方法回顾性分析国内9家中心2010年1月至2015年12月收治的经根治性手术治疗的进展期胆囊癌患者临床资料，纳入生存时间、阳性淋巴结数目（NMLN）、T分期、病理学分级、切缘、黄疸、肝脏浸润、年龄、性别、肿瘤形态10个变量因素，运用Bayesia Lab软件建立模型，基于树增益朴素贝叶斯算法建立以生存时间为目标节点的中位生存时间预测模型。采用混淆矩阵和受试者工作特征（ROC）曲线及ROC曲线下面积评价模型预测效果的优劣。运用Bayesia Lab进行10个变量因素的先验统计分析和以生存时间为目标变量、剩余因素为属性变量的后验分析，基于后验分析结果开展多态Birnbaum重要度计算，给出各属性变量的重要度排序。排序结果筛选前4种因素建立胆囊癌生存概率预测表。使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存分析采用Log-rank检验。结果共316例患者纳入研究，其中男性109例，女性207例，男女比例为1.0∶1.9，年龄（62.0±10.8）岁。R0切除298例（94.3%），R1切除18例（5.7%）。T分期：T3期287例（90.8%），T4期29例（9.2%）。总体中位生存时间（MST）为23.77个月，1、3、5年累积生存率分别为67.4%、40.8%、32.0%。正确预测值分别为121例（MST≤23.77个月）和115例（MST〉23.77个月），模型预测精确度为74.86%。生存时间的先验概率为0.503 2（MST≤23.77个月）和0.496 8（MST〉23.77个月）。重要度排序结果表明，NMLN（0.366 6）、切缘（0.350 1）、T分期（0.319 2）和病理分级（0.258 9）是影响患者术后生存时间的前4位预后因素。将NMLN、切缘、T分期和病理学分级4个因素作为观测变量，得出不同状态下患者处于各个生存时间段的概率。在此基础上，设计一种基于NMLN、切缘、T分期、病理分级的生存预测评分系统，4～9分患者的中位生存时间分别为66.8、42.4、26.0、9.0、7.5、2.3个月，差异有统计学意义（P〈0.01）。结论基于贝叶斯网络建立的进展期胆囊癌生存预测模型具有较高的准确性，NMLN、切缘、T分期和病理学分级是影响患者术后生存时间的预后因素，基于NMLN、切缘、T分期及病理分级的生存预测评分系统可用于进展期胆囊癌患者的生存预测与治疗决策指导。

摘要：目的构建表达人类白细胞抗原-G(HLA-G)基因shRNA载体,探讨其对NK细胞杀伤效应的影响。方法构建4个HLA-G-shRNA真核表达质粒,瞬时转染至人肝癌Bel-7402细胞,检测HLA-G mRNA和蛋白水平的表达。将NK-92MI细胞(效应细胞)与转染后的Bel-7402细胞(靶细胞)共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符。RT-PCR和Western blot结果均表明重组载体抑制了Bel-7402细胞HLA-G基因的表达。NK-92MI细胞对转染HLA-GshRNA的Bel-7402细胞杀伤作用明显增强(P<0.01)。封闭NK-92MI细胞KIR2DL4受体后,杀伤作用减弱(P<0.01)。结论成功构建了HLA-G shRNA载体,下调HLA-G可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应,HLA-G与NK细胞表面KIR2DL4受体结合后,向NK细胞传递抑制效应。

摘要：功能性重建骨盆肿瘤切除后残留的巨大骨缺损是骨肿瘤外科医师必须面对的巨大挑战。骨盆假体因具有较好的初始稳定性、外形更易被接受、以及功能恢复相对较快等特点,近年来逐渐成为骨盆恶性或侵袭性肿瘤切除后的主要重建手段。但传统骨盆假体仍然存在断裂、松动等风险。随着3D打印技术的发展,采用3D打印定制类骨小梁多孔结构骨盆假体已成功应用于临床,获得了较好的力学支撑和界面骨整合,而假体的设计优劣和应用是否规范直接影响使用效果。本共识以循证医学证据为基础,经全国骨肿瘤专家商议讨论,从定制式3D打印骨盆肿瘤假体的设计和临床应用等关键技术环节形成推荐意见,为此类假体的有效使用提供参考。