摘要：目的获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中前列腺癌特异性膜抗原（PSMA）表达的shRNA序列。方法根据PSMA基因信息，设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列，组建与之对应的4对互补的单链DNA序列，包括siRNA的正义链和反义链；正义链序列按5’向3’顺序依次为：酶切位点（BamHⅠ）、干扰序列（19bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoRⅠ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中，转染前列腺癌细胞后，通过real-time PCR检测不同序列片段对PSMA的mRNA抑制效果并通过Western blot检测对目的蛋白PSMA的抑制效果。结果设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好，目的序列位于PSMA（NM_0004476）的1207到1226，茎环序列为5’-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TFGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3’。其对前列腺癌细胞株中PSMA的mRNA的抑制率为60．0％，对其蛋白表达的抑制率为86％。转染细胞后，细胞可以稳定低表达PSMA。结论成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中PSMA表达的shRNA序列。

摘要：目的 建立稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中核因子NF-κB（p65）表达的shRNA序列,构建慢病毒载体,检测p65在前列腺癌细胞中的作用功能.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补单链DNA将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中转染前列腺癌细胞,采用RTPCR方法检测不同序列片断对p65 mRNA的抑制效率,免疫印迹方法检测其对p65蛋白表达的抑制效率.将获得的慢病毒载体感染LNCaP细胞,设对照组、空转组.采用MTT、流式细胞术、Transwell等方法检测p65的生物学作用.结果 设计的3条针对p65序列中,第3条序列对前列腺癌细胞株中p65 mRNA的干扰效率为59%,对蛋白表达的抑制率达81%.目的序列位于p65（NM_021975）的1096～1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGAT-GACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3＇.转染细胞后,细胞可以稳定低表达***检测实验组细胞96 h内未出现对数增殖,生长能力低于对照组和空转组.流式细胞检测实验组G0～G1期细胞百分率为61.49%,高于对照组的44.89%和空转组的41.52%;而S期细胞百分率为28.58%,低于对照组的47.36%和空转组的46.10%,差异有统计学意义（P＜0.05）.Transwell检测实验组透过细胞数为（16.5000±6.62076）个,低于对照组和空转组[（45.6333±13.54159）个,（36.8333±5.68412）个],差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中p65表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体;初步验证了p65在前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移中的促进作用.

摘要：目的:利用基因工程技术筛选获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP中前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体。观察转染前列腺癌细胞后对PSMAmRNA和蛋白表达的影响。方法:根据PSMA基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5向3顺序依次为:酶切位点(BamHⅠ)、干扰序列(19bp)、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19bp)、终止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoRⅠ)。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-timePCR检测对PSMA mRNA表达,通过Western blotting检测PSMA蛋白的表达。结果:设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好,目的序列位于PSMA(NM_004476)的1207到1226,茎环序列为5-GATCC GTCT-CAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTTG-3。其对前列腺癌细胞株中PSMA mR-NA表达的抑制率为60%,对PSMA蛋白表达的抑制率为86%。转染细胞后,细胞可以稳定低表达PSMA。结论:成功获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP PSMA表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体,pSIH-PSMA-siRNA2转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA表达的抑制率为60%,对PSMA蛋白表达的抑制率达86%。为后期研究PSMA在前列腺癌发病中的作用机制以及免疫导向治疗等提供了实验基础。

摘要：目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bel-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板，构建pGenesil-1-Bcl-2siRNA重组质粒，转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bel-2蛋白表达的影响，MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用，Annexin-V—PI双染法流式细胞术（FCM）检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bel-2 siRNA重组质粒，并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70％；转染重组质粒后，T24细胞的活力降低为（66．9±5．6）％；重组质粒组的T24细胞凋亡率为34．55％～45．39％。结论pGenesil-1-Bel-2 siRNA重组质粒明显下调Bel-2在膀胱癌细胞中的表达，并抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡。

摘要：目的:构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法:根据GenBank提供的bcl-2cDNA序列,设计双链小干扰RNA(siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(shRNA)的DNA序列,并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接,构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞,采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响;用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果:构建了bcl-2siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555,并经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72h后,RT-PCR显示bcl-2基因表达下调接近80%;MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论:bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建,有效沉默bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,抑制了癌细胞的生长。

摘要：背景：传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难。目的：实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性。设计：基础实验研究。单位：中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心。材料：实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。实验室级别为卫生部部属医院开放实验室。1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80~100g,由中山大学实验动物中心提供。新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心。方法：采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原。采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性。将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25ng/L血管内皮生长因子（VEGF165）的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性。体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况。主要观察指标：骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性。结果：①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%。②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维。体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好。③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长。结论：骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料。

摘要：背景:在肾移植慢性排斥中,性别、受体体内的激素水平以及雄性激素受体等因素可能对慢性排斥的发生起到一定作用。目的:观察性激素、雄激素受体拮抗剂及性别对雄性受体大鼠移植肾慢性排斥反应的影响。设计、时间及地点:观察对照动物实验,于2005-06/2007-06在中山大学动物实验中心完成。材料:以80只雄性Lewis大鼠为受者,雌性和雄性Fisher大鼠各40只作为供者,建立大鼠同种肾移植慢性排斥反应动物模型。方法:根据干预药物以及供体性别不同,将大鼠分为8组(n=10),分别为雄性供体对照组、雄性供体睾酮组、雄性供体雌二醇组、雄性供体氟他胺组及雌性供体对照组、雌性供体睾酮组、雌性供体雌二醇组、雌性供体氟他胺组。其中干预药物剂量分别为雌二醇0.025mg/kg、睾酮0.5mg/kg、氟他胺25mg/kg,2个阴性对照组未服用药物,喂养期为20周。主要观察指标:移植后每4周检测受体大鼠的24h尿蛋白、血肌酐及肌酐清除率;移植后20周处死受体大鼠,对移植肾进行显微镜检、免疫组化、核糖核酸酶保护测定。结果:①与阴性对照组相比,不论雄性还是雌性供体大鼠的24h尿蛋白水平在睾酮组均升高(P0.05)。②不同性别的供体以及不同药物对移植肾组织血管内膜增厚、肾小球硬化和间质纤维化程度以及单核巨噬细胞浸润、转化生长因子βmRNA表达程度均有一定影响。③雌性供体组的肾损伤大于雄性供体组。睾酮可以加重肾功能损伤,雌二醇、氟他胺可以减少肾功能损伤。结论:在大鼠同种肾移植慢性排斥动物模型上,供者的性别对移植肾的功能和组织形态具有明显的影响。睾酮可以加重慢性排斥反应的发生,雌二醇、氟他胺可以明显抑制慢性排斥反应的发生。

摘要：目的 获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中核因子[NF-κB（p65）]表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3 3条针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5＇向3＇顺序依次为：酶切位点（BamH Ⅰ）、干扰序列（19bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19 bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoR Ⅰ）.将合成的序列插入空载体pSI H1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time聚合酶链反应（PCR）检测不同序列片段对p65的mRNA抑制效果,通过Western blot检测对p65蛋白表达的抑制效果.从而获得可以稳定高效抑制前列腺癌细胞中p65表达的shRNA序列.结果 设计的3条针对p65的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于p65（NM_021975）的1096～1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTTTT G-3＇.其对前列腺癌细胞株中p65的mRNA的干扰效率为59%,对其蛋白表达的抑制率为81%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中p65表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.

摘要：目的获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中核因子kappa-B表达的shRNA序列。方法根据核因子kappa-B基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对核因子kappa-B基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列,组建与之对应的4对互补的单链DNA序列,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5’向3’顺序依次为:酶切位点(BamHⅠ)、干扰序列(19bp)、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19bp)、中止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoRⅠ)。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFPshRNAVector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-timePCR检测不同序列片断对核因子kap-pa-B的mRNA抑制效果。结果设计的3条针对核因子kappa-B的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于核因子KAPPA-B(NM_021975)的1096到1113,茎环序列为5'-GATCCGCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGATGACG-TAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3'。其对前列腺癌细胞株中核因子kappa-B的mRNA的干扰效率为59%,对其蛋白表达的抑制率为81%。转染细胞后,细胞可以稳定低表达核因子kappa-B。结论成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中核因子kappa-B表达的shRNA序列,为后期研究核因子kappa-B在前列腺癌发病中的作用机理等研究提供了基础。

摘要：背景：鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理或γ射线照射阻断其有丝分裂后，铺层的细胞可保持活力但不增殖，并能够在生长过程中产生促进胚胎干细胞生长的因子和抑制胚胎干细胞分化的因子，但其生命期有限。目的：探讨分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄与培养条件，以及用其制备细胞饲养层的效果。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-11／2006--07在广东省计划生育专科医院实验室完成。材料：清洁级昆明系孕7．5，10．5，13．5，16．5，19．5d雌鼠各5只。方法：无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离鼠胚成纤维细胞，调整细胞浓度为1×10^7L^-1、1×1097L^-1、1×10^11L^-1，胰酶消化传代。当胚胎成纤维细胞生长并相互接触时，加入丝裂霉素C作用2-4h，用无钙无镁PBS配制的胰蛋白酶液消化2-5min，终止后用吸管吹打皿底，使细胞充分分离，以含10％胎牛血清的DMEM液调整细胞浓度为1×10^8L^-1，将该悬液移入明胶处理的培养皿内常规培养，制备鼠胚成纤维细胞饲养层。主要观察指标：胎龄、细胞浓度、传代次数对鼠胚成纤维细胞生长增殖的影响。不同胎龄鼠胚成纤维细胞饲养层制备效果。结果：7．5-19．5d鼠胚均可分离出成纤维细胞，但7．5d，10．5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量少，寿命短，且混有大量杂细胞；13．5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量多，增殖快，所含杂细胞少：16．5～19．5d鼠胚分离所得成纤维细胞生长状态不良，增殖缓慢，杂细胞较多。同等条件下与1×10^7L^-1、1×10^11L^-1浓度比较，1×10^9L^-1浓度的鼠胚成纤维细胞生长状况良好，铺层时间适中，细胞寿命最长（P〈0.05）。以13．5d鼠胚成纤维细胞经初代培养后传4代，成功建立了成纤维细胞株，相同条件下14代细胞形态、体积、生长状况无明显差别。7．5～19．5d鼠胚成纤维细胞制备的饲养层，铺层时间基本相似（P〉0．05），细胞寿命均可维持一二周。结论：分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄及细胞浓度分别为13．5d与1×10^9L^-1，4代以内传代次数不影响鼠胚成纤维细胞的生长增殖，且不同胎龄所制备的饲养层细胞寿命无差别。