摘要：为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原 。

摘要：依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。

摘要：根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白基因vp73的序列,设计一对特异性检测引物,扩增片段251 bp,建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验,结果表明,3组引物的检测特异性相当,但本研究设计的引物灵敏度至少高出100倍。表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。

摘要：为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。

摘要：基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。

摘要：为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床样品进行检测。结果显示,该方法与口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒等牛、羊常见疾病病原无交叉反应;对两种重组质粒标准品的检出极限均为1×10~2copies/L;批内和批间重复试验的变异系数均小于2.55%。临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样品中BTV和EHDV的核酸。结果表明,本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以为BTV和EHDV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。

摘要：水泡性口炎病毒 (VSV)与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)具有相近的传播途径与类似的检测方法 ,本文参照文献报道的基因序列 ,设计合成了两对能分别扩增VSV( 2 0 2bp)、BVDV( 3 41bp)基因片段的引物 ,并对PCR扩增条件进行优化 ,建立了二重RT_PCR方法 ,可同时检测VSV与BVDV病毒核酸。VSV产物经测序显示与报道的核酸序列同源性为88 6%。二重RT_PCR同时检测VSV与BVDV经济、快速、敏感、特异 ,可用于实验研究和流行病学调查。

摘要：参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。

摘要：按照口蹄疫病毒 (FMDV )聚合酶 3D基因序列 ,设计合成了引物和探针 ,经各反应条件的优化 ,建立了实时荧光定量 RT- PCR技术 ,对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液中的 FMDV进行了特异性检测和敏感性试验。结果 ,用 30 0 nmol/ L 的引物浓度和 2 0 0 nmol/ L 探针浓度 ,获得的 CT值较小 ,而 ΔRn最大 ;可检测到相当于 0 .1 TCID50 的病毒 RNA;与 VSV和其他水泡性病毒不发生交叉反应 ;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系 ,且线性范围宽 ,相关系数为 0 .984 ;组内和组间试验重复性的变异系数 (CV)分别为 5 .4 %和 6 .7% ;与常规 RT- PCR相比较 ,该方法具有快速、特异、敏感、可定量 。

摘要：参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAV BHK21细胞培养物中提取总RNA,对AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析.与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94.2%～98.3%,推导的氨基酸的同源性为97.6%～100%,证实为AKV的N基因.为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.