摘要：目的开发和评估一种快速、简单和经济的替代测序的Omicron变异株荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)。方法针对SARS-CoV-2 ORF1ab保守区域、Omicron变异株S基因高频共同突变位点设计引物和TaqMan探针, 建立Omicron株RT-qPCR检测方法, 用经全基因组测序确定型别的样本进行验证, 并对该方法的特异度和敏感度进行评估。结果本研究建立的RT-qPCR分型法可以将Omicron变异株与包括早期A型流行株、Alpha和Delta变异株在内的SARS-CoV-2毒株进行区分, 结果与全基因组测序结果一致, 符合率为100.00%(28/28);与其他6种呼吸道病毒及柯萨奇病毒A组16型无交叉反应;该方法RNA标准品在109~103拷贝/μl之间呈良好的线性关系, 相关系数R2均大于0.99, 检测敏感度为103拷贝/μl。结论本研究设计的针对Omicron变异株的RT-qPCR敏感度高且特异度好, 在任何可以进行PCR检测的实验室中都容易开展, 可极大地促进对Omicron变异株的传播监测。

摘要：目的建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法。方法首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计。病毒在BHK21细胞或C6/36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录。以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测,并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价。结果Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性,可以检出所有12株Banna病毒,而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、batai病毒和环状病毒检测结果均为阴性。与传统PCR相比,敏感性高100倍以上,可以检出每50μl标本中含有0·5CCID50的Banna病毒。单链RNA变性条件(65℃)进行逆转录使检测结果的敏感性比99℃变性法最少低10倍。病毒在室温保存1天和4℃保存1周后,检出敏感性会比原来低10倍左右。该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时,均显示出较好的特异性。112份蚊标本中检出6份标本阳性,4份可疑阳性,病毒分离结果3份阳性。结论本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法,并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测,为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段。

摘要：目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法。方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBRGREENΙ荧光PCR和常规RTPCR扩增,并对SYBRGREENΙPCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃,最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBRGREENΙ荧光PCR方法进行检测。结果SYBRGREENΙ荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1PFU/ml。对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响。对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性。结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段。

摘要：目的:以实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)筛查社区获得性肺炎患者中的支原体肺炎(MPP)病例,并归纳总结MPP在人口统计学、临床表现、实验室检测和影像学表现的特点。方法:选取大理大学大理教学医院(大理市第一人民医院)2017年8月至2018年2月间共182例以肺炎收住入院的患者为研究对象,以RepMP1基因设计引物,用qPCR方法检测研究对象的呼吸道标本,收集182例患者临床资料。结果:共有12例病例诊断为MPP阳性,通过对这些患者的住院信息分析,发现这些患者普遍存在发热症状,且C反应蛋白较非MPP者更高。结论:qPCR方法可快速检测MPP病例,且MPP患者C反应蛋白相比其他社区获得性肺炎更高,可为临床诊断和治疗提供一定参考。