摘要：为建立一种快速、准确检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的二重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建方法特异性良好,与其他25种常见细菌均无交叉反应。猪丹毒杆菌检测在2.07×108~2.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到2.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%;溶血性曼氏杆菌检测在1.07×108~1.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到1.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的二重荧光定量方法和普通荧光定量方法对47份临床样品进行检测,符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。

摘要：为建立产气巴氏杆菌(***)的快速检测方法,本研究根据*** 16S rRNA基因的保守序列设计引物及TaqMan探针,并优化反应体系和反应条件,建立了*** TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线结果显示,质粒标准品在4.7×10^(6)拷贝/μL~4.7×10^(1)拷贝/μL和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2为0.992,扩增效率为98.29%。利用建立的TaqMan荧光定量PCR方法对***、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌等36种常见猪、牛、羊细菌病原检测均为阴性结果,特异性强;该方法对重组质粒标准品pMD19-PA的最低检测限为47拷贝/μL,敏感性高;该方法批内、批间重复性试验的变异系数在1.58%~2.55%,重复性好。利用建立的TaqMan荧光定量PCR和细菌分离方法对46份流产猪、牛和羊胎儿的样品进行***检测,结果显示前者的阳性检出率为23.91%(11/46),传统分离方法的阳性率为15.22%(7/46),两种方法总符合率为91.30%。本研究首次建立***的荧光定量PCR检测方法,为猪、牛和羊***的感染提供了敏感、快速和高通量检测方法。