摘要：本研究旨在对水牛水通道蛋白9(aquaporins 9,AQP9)基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。

摘要：试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1shRNA1276(77.8%和67.0%,P<0.05)。

摘要：本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。

摘要：靖西香糯是广西著名地方水稻品种,米饭水晶状、糯性强、香味浓、食味优,是优质糯稻的极品,主要缺点是高秆易倒伏,产量较低。为改良靖西香糯株高特性以及保持该品种的传统风味,本研究运用CRISPRCas9技术定向编辑调控水稻株高的SD1基因,在外显子区内设计了两个打靶效率高的靶序列,将这2个靶序列组装到PYLCRISPR/Cas9-MH上,通过农杆菌介导法转化靖西香糯,得到了株高显著变矮的半矮秆突变株系。结果表明,T0代共获得24株SD1突变株,转化植株突变率为85.7%,其中2个靶点同时突变频率占总突变的58.3%,双靶点纯合突变高达42.8%,其中3株(12.5%)是T-DNA-free纯合突变植株。利用T0代双靶点纯合突变T-DNA-free植株种子种植的T1代,检测到16个T-DNA-free植株,其中11个为半矮秆植株。结果还表明,在SD1基因第一外显子内单个碱基的替换或双等位的突变并没有对株高产生较大的影响,而第一外显子双位点缺失突变产生大片段缺失可导致内源GA水平显著降低,进而显著降低了株高。本研究为培育矮秆香糯水稻新品系提供了帮助,表明CRISPR-Cas9应用可高效地定向改良水稻品种,研究结果也为应用现代生物育种技术更好地利用传统资源提供了一个范例。

摘要：本试验旨在构建4条针对Iqcf5(IQ motif containing F5)基因的sh RNA干扰载体,并进行有效干扰靶点的筛选,为以后进一步对Iqcf5基因功能的研究奠定基础。提取成年小鼠睾丸组织的RNA,进行反转录,扩增Iqcf5基因的编码区,并将其克隆到真核表达载体HP362-PBL-PBR-CAG-m Cherry-WPRE上。设计针对Iqcf5基因的sh RNA序列,应用基因重组技术插入到p GPU6/GFP/Neo载体中,将其与Iqcf5基因的真核表达载体共转染293T细胞,进行有效干扰靶点的筛选。构建了Iqcf5基因的真核表达载体和4条针对目的基因Iqcf5的sh RNA,分别是Iqcf5-107、Iqcf5-257、Iqcf5-425和Iqcf5-500和一个阴性对照质粒,经测序鉴定正确,共转染293T细胞,经过筛选Iqcf5-257和Iqcf5-500在293T细胞中对Iqcf5基因表达的干扰效果最佳。成功构建了Iqcf5基因的真核表达载体及其sh RNA干扰载体,并在工具细胞293T中进行了有效干扰靶点的筛选,这为下一步对Iqcf5基因功能的研究奠定了基础。

摘要：[目的]明确广西西部地区靖西(JX)、凌云(LY)、德保(DB)和乐业(LeY)等4个县市烟草曲叶病的病原。[方法]2010年5-6月分别从广西靖西、凌云、德保和乐业等县市采集具有典型曲叶症状的烟草叶片,用基于双生病毒DNA保守序列设计简并引物Bego-1和Bego-6对病叶组织总DNA抽提物进行PCR扩增和对PCR产物进行序列测定,用BLAST、Vector NTI、MEGA 4.0和Simplot program 3.2软件等进行病毒序列分析、系统进化树构建和病毒重组分析。[结果]从选取的9个表现典型曲叶症状的样品叶组织总DNA抽提物中均可扩增出约1500bp与预期大小相符的DNA片段。测序和序列比对分析显示,9个样品扩增产物核苷酸序列相似性为73.7%～99.2%,与已报道的双生病毒具较高的相似性。其中,JX-2与中国番茄曲叶病毒广西番茄分离物(G32)的相似性最高,达99.2%;JX-3和JX-5与云南胡椒曲叶病毒云南辣椒分离物(YN323)相似性最高,分别为92.5%和93.4%;LeY-1、LY-1、DB-1、JX-1、JX-4和JX-6则与中国番茄黄化曲叶病毒中国番茄分离物(CHI)和广西烟草分离物(G102)的相似性最高,均高于95.0%。基于PCR扩增产物及已报道的双生病毒属代表种相应核苷酸序列构建的系统进化树分析表明,9个广西烟草分离物分属3个簇群:中国番茄曲叶病毒簇、云南辣椒曲叶病毒簇和中国番茄黄化曲叶病毒簇。重组分析结果表明:JX-3是云南辣椒曲叶病毒和中国番茄曲叶病毒的重组病毒,JX-5是云南辣椒曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒的重组病毒。[结论]9个广西烟草分离物分属于4种双生病毒:中国番茄曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒,以及分别由上述两种病毒与云南辣椒曲叶病毒重组而来的2种重组病毒。其中,中国番茄曲叶病毒自然侵染烟草、云南辣椒曲叶病毒和中国番茄曲叶病毒及中国番茄黄化曲叶病毒的重组病毒等结果此前均未见报道。

摘要：植物病原菌通过T3SS(typeⅢsecretion system)注射TALEs(transcription activator-like effectors)即转录激活类效应物进入寄主细胞并诱导寄主基因表达。TALEs通过重复氨基酸序列模块-对应识别DNA碱基序列并与之结合,激活基因转录。TALEs识别碱基的模块能够被预测和设计,可根据此推测其在植物中的功能和合成理想的靶DNA结合序列。利用植物与TALEs之间的抗性机制为疾病控制提供新的策略。

摘要：【目的】在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)GX-3中发现了一个编码中性p H范围内起作用的蔗糖酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行克隆表达及纯化,并研究该蔗糖酶的酶学性质,为蔗糖酶的应用研究及开发利用奠定基础。【方法】通过查找Gen Bank数据库中来自阴沟肠杆菌同属中的编码蔗糖酶的基因序列,对这些序列进行比对分析设计简并引物扩增保守区;利用PCR扩增目的基因,以p QE30为表达载体构建重组质粒;镍亲和层析纯化重组蛋白,对重组酶的酶学性质进行详细研究。【结果】一个编码蔗糖酶的基因(Einv)被从阴沟肠杆菌GX-3中发现和克隆。生物化学特性鉴定表明这个蔗糖酶的活性最适温度为40℃和最适p H为6.5。凝胶渗透色谱法分析显示Einv是以二聚体的形式存在。Einv这个蔗糖酶在1170 mmol/L的蔗糖条件下仍保留有80%以上的水解活性。而在高浓度的蔗糖条件下,Einv只有水解活性而没有转糖基的副反应发生。它能够水解棉子糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和水苏糖。【结论】获得的Einv是一个在中性p H范围内起作用的β-呋喃果糖苷酶,只有水解功能而没有转糖基功能。这些特性表明这个中性蔗糖酶在食品工业具有重要的应用价值。

摘要：为了研究GLUT 3的功能,试验根据GenBank中公布的牛、人等物种的GLUT 3核苷酸序列设计、合成1对引物,以水牛卵巢组织总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增出GLUT 3成熟蛋白编码cDNA序列,将此扩增产物克隆入pMD 18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明:扩增的水牛GLUT 3基因CDS序列长为1 701 bp,经相关生物软件预测,该基因编码494个氨基酸。水牛GLUT 3基因ORF序列与牛、山羊、人、大鼠、猪同源性分别为100%、100%、99%、94%和81%;蛋白序列与牛、山羊、人、大鼠、猪同源性分别为100%、99%、99%、99%和97%。说明GLUT 3是一组在进化上高度保守的蛋白质。

摘要：利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。