摘要：为探讨甲基转移酶抑制剂5-aza-dc、去乙酰基转移酶抑制剂TSA对广西陆川猪体细胞核移植效率的影响,用5-aza-dc、TSA处理供体细胞和重构胚。结果显示,5-Aza-dc联合TSA处理供体细胞、重构胚以及连续处理供体细胞和重构胚,桑椹胚率均显著高于对照组(P<0.05),但各组间囊胚率差异不显著。说明5-aza-dc联合TSA处理供体细胞和克隆胚能提高猪克隆胚的发育能力,尽管差异不显著。

摘要：狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。

摘要：为研究猪miR-148a(ssc-miR-148a)的转录调控机制,对其启动子进行了克隆及分析。本试验首先设计特异性PCR扩增引物,分别得到ssc-miR-148a前体上游3个片段,并将其连接到荧光素酶报告载体pGL3-Basic上。通过生物信息学方法,在线分析ssc-miR-148a启动子大概区域、甲基化部位和转录因子结合部位。将重组报告质粒转染293T细胞,分析启动子活性。采用不同浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)处理猪成纤维细胞和转染有重组报告质粒的猪成纤维细胞,检测ssc-miR-148a和DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的表达,及其对启动子活性的影响。结果显示,克隆得到的ssc-miR-148a启动子区2 043bp片段具有启动子活性,该序列存在5个CpG岛、Sp1及AP2等转录因子结合位点。0、5和10ng·mL-1浓度bFGF处理猪成纤维细胞和转染重组报告质粒的猪成纤维细胞后,ssc-miR-148a表达均显著下降(P0.05)。结果表明,ssc-miR-148a启动子位于前体上游2 043bp片段内,启动子区域有转录因子SP1结合位点,其表达受bFGF的调控。

摘要：目的:纤维素酶水解天然纤维素产生易被微生物利用的葡萄糖是进行生物炼制的关键。丝状真菌分泌的纤维素酶大多数是经过糖基化修饰的,研究丝状真菌纤维二糖水解酶(Cel7A)的催化功能域N-糖基化修饰对其分泌及酶活的影响,有助于优化纤维素酶的表达。方法:利用定点突变将草酸青霉和深绿木霉Cel7A催化功能域的N-糖基化位点去除,构建突变体PoCel7A^(*)和TaCel7A^(*)。以草酸青霉为宿主构建分泌表达PoCel7A^(*)、TaCel7A和TaCel7A^(*)的重组菌,检测N-糖基化去除对Cel7A分泌和酶活力的影响。结果:PoCel7A催化功能域的N-糖基化去除对其蛋白分泌和酶活力无影响。TaCel7A催化功能域的N-糖基化去除不影响其蛋白分泌;但突变体的pNPCase、FPase和Avicelase酶活力分别下降了21.2%,15.2%和17.6%。去除Cel7A催化功能域N-糖基化,加强了细胞内UPR响应。外源蛋白TaCel7A和TaCel7A^(*)的表达也加强了胞内UPR响应。结论:不仅可以为丝状真菌Cel7A的酶工程改造提供理性设计思路,而且为进一步了解糖基化在纤维素酶降解纤维素过程中的作用及机理奠定一定基础。

摘要：为加强SrMV在蔗区的流行动态监控,本研究建立了反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法。实验中针对SrMV外壳蛋白(coat protein,CP)保守序列设计特异性引物,构建了含CP基因的标准质粒用于RT-LAMP反应体系的优化,并采用实时浊度仪和优化的荧光可视化检测方法进行了特异性、敏感性及符合性实验。结果显示,RT-LAMP方法特异性强,可检测到的标准质粒的最低量为2.02 fg,其灵敏度是RT-PCR的100倍,对田间样品的检测结果与RT-PCR相符。建立的RT-LAMP方法特异性强、灵敏性高、操作简便,可用于甘蔗健康种苗中SrMV的检测及蔗区中SrMV流行动态监控。

摘要：为了解转录激活与信号转导因子5(STAT5)在水牛乳腺发育及泌乳生理中的功能,对水牛STAT5a和STAT5b基因的5′调控区启动子序列进行了克隆,并比较其活性.根据GenBank已公布的牛STAT5a和STAT5b基因序列设计特异性引物,以广西本地水牛乳腺组织基因组DNA为模板,通过PCR法分别扩增不同长度STAT5a和STAT5b基因启动子片段并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的水牛STAT5a基因启动子片段(P1和P2)大小是500bp,700bp,STAT5b基因启动子片段(P3,P4和P5)大小是500bp,800bp,1 500bp.在线分析结果显示,仅P2片段中存在高甲基化位点,且富含SP1,AP2等转录因子结合位点.将构建的不同长度启动子片段分别连入pGL3-Basic载体,分别转染水牛乳腺上皮细胞,检测荧光素酶表达水平.与未转染组相比,P1~P5质粒转染组的荧光素酶比值均显著提高(p<0.05);添加5mg/mL质量浓度催乳素(PRL)处理乳腺上皮细胞,P3质粒转染组的荧光素酶比值显著高于其他各组(p<0.05).以上结果表明,水牛STAT5a和STAT5b基因启动子活性均受到PRL调节,两者表达水平在水牛乳腺上皮细胞中不同,且STAT5b基因表达受PRL调控更为明显.

摘要：荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)是植物分子细胞遗传学研究最为重要的手段之一。近些年,基于参考基因组设计的低拷贝寡聚核苷酸探针在FISH中应用得越来越广泛。然而,由于植物基因组中分布大量的重复序列,这使得oligo-FISH的分辨率存在一定局限性。利用包含多个荧光基团的荧光PCR引物,扩增出甘蔗染色体特异oligo探针,并进一步优化甘蔗的荧光原位杂交体系,提高了甘蔗oligo探针识别近缘物种染色体的效率。通过开发多荧光标记的甘蔗oligo探针以及甘蔗荧光杂交体系的优化,有效拓宽荧光信号的最小分辨率,提高信噪比(signal-to-noise ratio,SNR),并成功基于甘蔗oligo探针对高粱1-10号染色体分型。多荧光标记引物增强oligo探针信号的新方法及FISH体系的优化为今后在其他物种中提高oligo-FISH鉴定染色体及捕捉微弱的荧光信号提供了参考。

摘要：为建立广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞体外培养体系,以新生巴马小型猪为试验材料,使用微量液体组织块贴壁法原代培养分离几种成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;根据细胞的形态、生长特性等观察其体外生长能力和增殖寿命。结果显示,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞获得成功分离,体外可以传代和冷冻;冷冻复苏后仍可以正常培养和传代;腹部成纤维细胞免疫荧光检测结果显示波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性。研究成果可为显微操作核移植、手工核移植和转基因相关操作等提供不同类型的供体材料。

摘要：本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系。观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较了化学辅助手工去核法和荧光染色去核法、不同类型的供体细胞(颗粒细胞、新生巴马肌肉成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)和供体细胞的不同处理方法(70%～80%汇合、血清饥饿法和100%接触抑制法)对重构胚发育能力的影响。结果表明:(1)利用DC诱导去核,对体外成熟培养44h的卵母细胞以浓度0.4μ***-1作用0.5～1h为宜。(2)用DC化学辅助手工去核与用荧光染色去核的重构胚囊胚发育率差异不显著(13.11%vs 9.25%,P>0.05)。(3)以胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞为供体构建的重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率均差异不显著(P>0.05)。(4)用70%～80%汇合(对照组)组、接触抑制组和血清饥饿组的细胞作供体构建的重构胚,在融合率上,接触抑制组显著高于对照组(P0.05)。研究结果表明,化学辅助手工去核法在实际生产中可以替代荧光染色去核法,能省去去核过程中荧光染色及紫外光照射去核等步骤,从而简化了猪手工体细胞核移植程序,提高了猪手工体细胞核移植效率,能为高效的猪手工体细胞核移植技术体系的建立提供参考。

摘要：高粱(Sorghum bicolor)是禾本科(Poaceae)一年生草本植物,也是研究C_(4)植物的模式生物。甜高粱相对于普通高粱有其独特的糖代谢积累机理,发掘其糖合成、运输和积累相关的调控基因和代谢途径,有助于糖分和碳源分配的遗传改良设计,又可为其他重要的C_(4)作物提供参考。本研究结合基因组、转录组和代谢组等多组学数据,从蔗糖转运、蔗糖合成相关基因家族以及基因共表达网络等多个角度对甜高粱及高粱的组学数据进行比较分析。结果如下:(1)构建了甜高粱及普通高粱品种的泛基因组,大小为908 Mb,比单个参考基因组增加约24.6%,进行了核心基因、非核心基因以及基因组存在/缺失变异区域相关基因的分类统计及功能富集分析,对多样本多个时期的RNA-seq数据进行差异表达分析,构建基因共表达网络,对基因集进行筛选验证,进一步筛选得到了糖分相关基因;(2)利用12份不同时期的甜高粱(Rio)、高粱(BTx406)以及两者子代(R9188)的RNA-seq数据进行差异表达分析与基因共表达分析,通过与对应时期蔗糖浓度变化数据进行相关性分析,得到与蔗糖代谢相关的基因集。研究成果有助于揭示甜高粱与高粱糖分差异原因,为高粱品种改良及育种相关研究提供借鉴。