摘要：构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。

摘要：目的研究超声微泡介导ABCB1a基因siRNA质粒转染L2RYC细胞的效率以及对ABCB1a水平和P-糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)表达的影响。方法制备脂质微泡;设计4对siABCB1a序列,并构建4种真核表达质粒pSES-siABCB1a;转染L2RYC细胞(单纯质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组、质粒+微泡+超声组),另设空白对照组。采用流式细胞术检测质粒的转染效率;实时荧光定量PCR及Western blot检测转染后L2RYC细胞中ABCB1a基因及P-gp的表达。结果 4种pSES-siABCB1a质粒经PCR、双酶切及测序证实构建正确;质粒+微泡+超声组pSES-siABCB1a质粒可高效转染L2RYC细胞,可见荧光表达,转染效率为(49.35±5.89)%;转染后ABCB1a基因mRNA及P-gp的表达均明显降低(P<0.05)。结论超声微泡可促进外源基因体外转染L2RYC细胞,siABCB1a能有效抑制ABCB1a基因和P-gp的表达。

摘要：目的探讨慢病毒载体介导短发夹RNA(shRNA,siRNA前体)靶向沉默HOXA10基因对U937细胞增殖、凋亡和形态的影响。方法设计并构建4条针对HOXA10基因的shRNA质粒表达载体,并构建HOXA10基因的过表达质粒,将4条干扰质粒分别和过表达质粒共转染293T细胞,用Western blot检测出敲减效果最好的1条质粒并包装成慢病毒(lenti-shHOXA10);将U937细胞分为干扰组(lenti-shHOXA10)、阴性对照组(lenti-NC)和未处理组,通过流式细胞仪测定慢病毒对U937细胞的感染效率并用real-time PCR、Western blot方法测定对HOXA10基因的沉默作用;瑞氏染色观察3组细胞形态上的变化;MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术检测3组细胞凋亡率。结果成功构建了有效沉默HOXA10基因的慢病毒-shRNA载体。干扰组HOXA10 mRNA的沉默效率为(92.3±1.3)%,蛋白表达水平下降91.1%,干扰组细胞抑制率为(43.9±0.7)%,与阴性对照组、未处理组相比差异有统计学意义(P<0.05);瑞氏染色显示干扰组细胞核质比减小、核分裂相少见;干扰组细胞凋亡率为(27.1±1.4)%,显著高于阴性对照组的(19.4±1.9)%和未处理组的(5.5±1.3)%(P<0.05)。结论慢病毒载体介导的shRNA可稳定地降低HOXA10基因的表达水平,有效抑制U937细胞增殖和促进其凋亡,HOXA10基因有望成为白血病基因治疗的新靶点。

摘要：目的应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带siANGPTL4基因的重组腺病毒,进一步研究ANGPTL4基因对骨肉瘤细胞株MG63增殖的影响。方法将设计的siRNA靶点寡聚核苷酸克隆到pSES-HUS载体构建重组质粒pSES-siANGPTL4,在B J5183大肠杆菌内与pAdEasy1骨架质粒完成同源重组;经脂质体介导转入HEK293细胞包装、扩增并经反复感染获得携带siANGPTL4基因的重组腺病毒Ad-siANGPTL4;有限稀释法检测病毒滴度;根据加入的重组腺病毒携带的基因不同将实验细胞分为阴性对照组、RFP组(加入Ad-RFP)、ANGPTL4组(加入Ad-ANGPTL4)及siANGPTL4组(加入Ad-siANGPTL4),利用腺病毒感染人骨肉瘤细胞株MG63,RT-PCR法检测细胞内ANGPTL4基因相对表达强度。结晶紫染色及细胞计数观察ANGPTL4基因对MG63细胞增殖的影响。结果成功构建携带siANGPTL4基因的重组腺病毒Ad-siANGPTL4,病毒滴度达1.2×1011～2.6×1011efu/m l;阴性对照组、RFP组、ANGPTL4组及siANGPTL4组细胞ANGPTL4基因表达的相对强度分别为(104.87±5.21)、(110.95±4.15)、(145.24±7.26)、(72.81±3.61);siANGPTL4组相对表达强度显著降低(P<0.05)。结晶紫染色及细胞计数显示,ANGPTL4基因过度表达可促进MG63细胞增殖;该基因抑制后MG63细胞增殖明显减缓(P<0.05)。结论成功构建了Ad-siANGPTL4重组腺病毒并感染MG63使其内源性表达的ANGPTL4基因沉默;该基因的表达沉默抑制MG63细胞体外增殖。

摘要：目的构建携带磁共振报告基因magA的慢病毒载体质粒,初步检测其体外转铁效应。方法采用人工DNA合成技术合成目的基因magA,DNA重组技术将magA基因连接入慢病毒表达载体质粒pLenti-EGFP,酶切及DNA测序鉴定重组质粒pLenti-EGFP/magA的准确性。包装、包膜及重组质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集包被magA基因的慢病毒上清并感染293T靶细胞,细胞培养基内加入500μmol/L枸橼酸铁连续4次传代,荧光显微镜观察并提取细胞行台盼蓝排除实验和普鲁士蓝染色,同时设立对照组行同样方法实验。结果酶切和DNA测序分析证实magA基因准确克隆入慢病毒表达载体设计位点,合成目的基因序列与GenBank中magA序列完全一致。荧光显微镜下观察包装细胞293FT细胞质内有大量绿色荧光表达,病毒滴度达到108 Tu/μl。慢病毒感染293T靶细胞后,细胞内稳定表达EGFP,且效率>80%。实验组及对照组台盼蓝拒染率分别为(92.80±2.65)、(93.50±1.29),2组拒染率差异无统计学意义(P>0.05)。普鲁士蓝染色发现实验组细胞内有大量蓝染铁颗粒形成,对照组呈阴性。结论 成功构建了携带磁共振报告基因magA的慢病毒表达载体,证实了magA基因在哺乳动物293T靶细胞内的转铁作用。

摘要：目的：构建视黄酸核受体a（RARa）的siRNA重组腺病毒，为反向研究RARa受体在全反式视黄酸（ATRA）抗凋亡过程中的作用提供实用的技术手段。方法：设计3对大鼠RA风的siRNA序列，将其分别克隆到pSES-HUS穿梭质粒；进而将重组穿梭质粒pSES-HUS-siRARa与pAdEasml在BJ5183感受态大肠埃希菌内同源重组以得到pAd-siRARa，PacI酶切线性化后转染HEK293进行包装扩增以得到重组腺病毒Ad-siRAR^Ad-siRARa感染大鼠PCI2细胞48h，提取各组mRNA和总蛋白，Real-timePCR和免疫印迹检测Ad-siRAR^-I、一2、一3对RARQ的抑制效率。结果：PCR、酶切及测序均证实RARa的siRNA序列正确克隆至腺病毒质粒载体，经过包装扩增得到大量高滴度重组腺病毒Ad-siRARa，而且对RARa的表达抑制效率接近70％。结论：成功构建视黄酸核受体RARⅡ的siRNA重组腺病毒，并具有下调PCI2细胞RARa基因和蛋白表达的功能。

摘要：目的:设计并构建能有效下调Ezrin蛋白表达的短发夹状RNA(Small hairpin RNAs,hRNA)表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于预防性治疗骨肉瘤肺转移的可行性。方法:依据小干扰RNA(Small interfering RNAs,iRNA)靶序列的设计原则,以Ezrin蛋白编码基因Villin2为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pGenesil-1质粒中,转化后进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞株,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞Ezrin蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果:成功构建2个针对Ezrin蛋白的shRNA表达载体;其转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞后,细胞Ezrin蛋白表达在mRNA及蛋白水平上的表达均显著下降。结论:Ezrin蛋白的shRNA表达载体能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR106细胞Ezrin蛋白的表达,本研究为预防性治疗骨肉瘤肺转移的实验奠定基础。

摘要：循证医学为麻醉学七年制教学提供了一种新的模式和方法。导师结合循证医学方法指导学生开展信息检索、综述撰写、临床病例讨论、课题设计等实践与训练,提高医学生主动学习和解决问题的能力,为规范其今后的临床实践行为打下基础。将循证医学引入七年制麻醉学教学中,将会对麻醉学教学的进一步发展、培养高素质的麻醉学人才和提高医疗质量产生重大而深远的影响。

摘要：构建小鼠Smad6基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞(BMDC)的Smad6基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于哮喘等自身免疫疾病的研究。设计小鼠Smad6 shRNA序列,合成、退火,得到双链DNA,与经酶切后的Psih1-H1-copGFP shRNA Vector载体连接产生LV-shSmad6慢病毒载体,并测序鉴定。转染293TN细胞,包装产生慢病毒,测定滴度。感染小鼠骨髓树突细胞,检测Smad6基因的表达状况成功构建Smad6 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad6。包装慢病毒,并显著抑制Smad6 mRNA水平及蛋白水平的表达。成功构建出小鼠Smad6基因shR-NA慢病毒载体,为后期研究Smad6基因在哮喘发病机制及新治疗方法提供了稳定的转染细胞载体。

摘要：目的：分析儿童睾丸卵黄囊瘤的诊断与治疗，以提高其临床诊治水平。方法回顾性分析本院1995年至2014年收治的61例儿童睾丸卵黄囊瘤患儿的临床资料。结果61例均以阴囊包块就诊，其中60例无痛；61例体查均有阴囊沉重感，透光试验均为阴性；3例提睾反射消失，6例误诊为鞘膜积液，4例初诊腹股沟疝，2例睾丸炎症，1例误诊为腺瘤。术前AFP值均增高，超声检查提示实性包块，CDFI提示84．8％睾丸肿块血流丰富。阴囊X线片均未见确切钙化影。60例行瘤睾高位切除术，1例行睾丸肿瘤剥除术，11例加行腹股沟区淋巴结清扫术。病理检查多见疏网状、腺泡样以及乳头样结构。2009年以前术后化疗采用博来霉素＋长春新碱，近5年采用PEB（顺铂＋足叶以带＋博来霉素）方案、PVB（顺铂＋长春新碱＋博来霉素）方案或二者交替化疗。术后1～2个月随访AFP值多降至正常，无一例复发或死亡。结论儿童睾丸卵黄囊瘤多因无肿痛性肿块就诊，体查包块有沉重感，AFP值升高，超声检查可见实质性包块。胸片和腹部超声可协助肿瘤临床分期。手术方案主要为高位瘤睾切除术，术中冰冻切片能协助术者选择手术范围，术后配合化疗，患儿临床预后效果好。