摘要：目的为哮喘等Ⅰ型变态反应性疾病的靶向信号转导分子治疗寻找药物设计新靶点提供基础。方法应用钙离子荧光指示剂Fluo-3，通过流式细胞仪和激光共聚焦荧光显微镜分析肥大细胞RBL-2H3活化时细胞内钙离子浓度（［Ca2＋］i）的变化和细胞外钙离子浓度对释放组胺的影响，观察钙离子信号与肥大细胞活化的关系。结果抗原可使致敏RBL-2H3细胞迅速释放组胺和升高［Ca2＋］i，90~110s时最强达（525±42）nmol／L（n＝12），激光共聚焦荧光显微镜观察到胞浆内充满绿荧光；胞外加入钙离子螫合剂EDTA后［ca2＋］i为（80±4）nmol／L，与基础［Ca2＋］i（79±3）nmol／L差异无显著性（P＞0．05，n＝12）；但显著增高磷酸酪氨酸浓度；加入佛波酯后再加入DNP－BSA，前后［Ca2＋］i差异无显著性（P＞0．05，n＝8）。结论　钙离子参与致敏肥大细胞的抗原活化过程。

摘要：目的建立较简便、敏感的Ｂ细胞恶性肿瘤微小残留病（ＭＲＤ）检测方法。方法根据免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因的保守序列设计引物，应用半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）基因扩增技术检测克隆性ＩｇＨ基因重排。结果该方法敏感性达１０－３。６２例Ｂ细胞恶性肿瘤患者，５１例检测到克隆性ＩｇＨ基因重排，阳性率为８２％，假阴性率为１８％（１１／６２）。同时检测３５例非Ｂ细胞恶性肿瘤患者和２０例正常人均阴性，无假阳性。检测１４例Ｂ细胞非何杰金淋巴瘤患者形态学检查正常的骨髓标本，ＭＲＤ检出率为７１％（１０／１４）。随访５例处于完全缓解期的Ｂ细胞型急性淋巴细胞白血病患者，６个月内ＭＲＤ均阳性，１２个月后３例转阴性，２例持续阳性，１８个月后持续阳性的２例患者均复发，而转阴性的３例仍处于完全缓解状态。结论半巢式ＰＣＲ检测克隆性ＩｇＨ基因重排，方法简便，敏感性和特异性高。

摘要：目的用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期发现和临床诊断。方法针对PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-PDC-E2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PDC-E2重组质粒。IPTG诱导表达后,获得PDC-E2融合蛋白。经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的免疫原性。结论获得PBC特异性靶抗原的多肽片段,为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具。

摘要：目的建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因表达含量的实时荧光定量逆转录（FQ-RT）-PCR法，探讨其在健康对照者、乙型病毒性肝炎肝硬化患者及原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者外周血单个核细胞（PBMC）中的表达状况。方法设计TRAIL基因的特异性引物和TaqMan-MGB探针，以B-actin基因为内参，RT-PCR扩增目的片段，胶回收纯化目的片段，构建克隆载体作为定量模板，在ABI Prism7000型荧光定量分析仪上进行扩增，建立标准曲线；同时检测30名健康对照者、30例PBC患者及25例乙型病毒性肝炎肝硬化患者外周血PBMC中TRAIL基因的荧光强度和循环阈值，计算样本中TRAIL基因的起始拷贝数。结果FQ-RT-PCR检测TRAIL mRNA的线性范围为10^3～10^9拷贝／μg RNA（r=-0．997）；高浓度样本批内和批间变异系数（CV）分别为5．6％和6．3％，低浓度样本批内及批间CV分别为12．5％和14．6％。PBC患者TRAIL mRNA表达量为[（3．3±2．5）×10^5拷贝／μg RNA]，高于健康对照组[（0．5±0．2）×10^5拷贝／μg RNA]，两组差异有统计学意义（t=5．994，P〈0．01）；乙型病毒性肝炎肝硬化患者TRAIL mRNA的表达[（2．1±0．9）×10^5拷贝／μg RNA]亦高于健康对照组，且差异有统计学意义（t=8．536，P〈0．01），而两疾病组间差异无统计学意义（t=1．988，P〉0．05）。结论成功建立检测TRAIL mRNA的FQ-RT-PCR法，并初步发现TRAIL mRNA在PBC及乙型病毒性肝炎肝硬化患者外周血PBMC中表达升高，这将对肝硬化肝损伤机制研究提供新的思路。

摘要：目的建立检测人Toll样受体3（TLR3）mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录PCR（FQ-RT-Pert）法，及探讨其在外周血单个核细胞（PBMC）中的表达水平。方法用Beacon Designer2．1软件设计TLR3基因特异性引物和荧光探针，逆转录扩增目的片段，构建重组体pMD18-T-TLR3作为定量标准品。在ABIPrism7000型荧光定量分析仪上，通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板，建立标准曲线；并检测30名正常人及20例原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者，20例慢性乙型肝炎肝硬化患者外周血PBMCTLR3基因的荧光强度，根据标准曲线及循环阈值，由软件自动计算样本中TLR3mRNA的起始拷贝数。结果FQ-RT-PCR检测TLR3基因的线性范围为10^2～10^8拷贝数／μl RNA（r=0．9974），内参β-actin的线性范围为10^3～10^8拷贝数／μl RNA（r=-0．9984）；高浓度样本批内和批间变异系数（CV）分别为6．7％和8．7％，低浓度样本批内及批间CV分别为12．3％和14．0％，30名健康人，20例PBC及20例慢性乙型肝炎肝硬化患者PBMC中均有TLR3 mRNA的表达，分别为3．46×10^2～4．51×10^3拷贝／μg RNA、4．92×10^2～1．42×10^4拷贝／μg RNA和2．58×10^2～7．17×10^3拷贝／μg RNA。结论成功建立检测TLR3 mRNA的FQ-RT-PCR方法，可作为临床和基础研究TLR3基因表达的工具。

摘要：为探索与自身免疫病发病密切相关的B细胞活化因子(BAFF)基因高水平转录的启动序列及IFN-γ等炎性细胞因子对其活性的影响,以人BAFF基因转录起始点上游-1 349 bp至-329 bp的片段为靶序列,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,脂质体转染法转染上述重组体至人骨髓白血病细胞株:HL-60,CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性;同时加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF蛋白(rBAFF),以测定其对BAFF启动序列的影响。结果表明,-1 349^-329 bp、-1 349^-743 bp序列具有强启动调控活性,而-1 349^-1 099 bp片段启动活性最低。细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF均能在一定程度上调人BAFF基因的启动活性,IL-4则一定程度地抑制BAFF基因的启动活性。研究提示,人BAFF基因-1349^-743 bp片段是进一步研究BAFF基因转录相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。

摘要：B细胞活化因子(BAFF)的异常表达与骨髓瘤、淋巴瘤的发病相关,为探索常见炎性细胞因子是否能影响人骨髓白血病细胞HL-60中BAFF的表达,以细胞因子IFN-γ、IL-10和IL-4刺激体外培养的HL-60细胞1~3 d后,采用流式细胞术、ELISA和荧光定量RT-PCR方法检测BAFF的核酸和蛋白表达含量的变化。结果显示,细胞因子IFN-γ、IL-10干预后,HL-60细胞表面BAFF蛋白表达水平、细胞上清液中BAFF蛋白含量、细胞内BAFF mRNA的含量均能明显升高(P<0.05),其中在INF-γ、IL-10干预的第1天,HL-60细胞内BAFF mRNA的含量为最高;在干预的第2天,HL-60细胞的上清液中BAFF蛋白含量及细胞表面BAFF蛋白表达水平均达最大值;而IL-4干预HL-60细胞后,仅对细胞上清液中BAFF蛋白水平稍有降低(P<0.05),细胞表面BAFF蛋白表达水平和细胞内BAFF mRNA的含量均无显著性差异。研究提示,INF-γ、IL-10可能是通过促进HL-60细胞对BAFF核酸的表达来上调BAFF蛋白的合成与分泌,而IL-4则仅能一定程度的降低HL-60细胞对BAFF蛋白的分泌...

摘要：目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,多表位肽(10μmol)能刺激全部10例HLA-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖,SI为46.2±5.6;增殖反应明显高于单肽(平均SI为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μmol)的T2细胞作为靶细胞,多表位肽诱导的CTL作为效应细胞,多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(86.2±9.6%),显著高于单肽[平均为(25.4±3.6)%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。

摘要：目的研究建立实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测人B细胞激活因子受体(BAFF-R)含量的方法,及探讨其在外周血单个核细胞(PBMC)中BAFF-R mRNA表达的检测价值.方法在BAFF-R基因高保守区设计特异性引物和荧光探针,用逆转录(RT-PCR)扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BAFF-R mRNA含量,并以 BAFF-R mRNA和β2M mRNA含量的比值进行BAFF-R表达水平评价.结果 RFQ -PCR检测BAFF-R含量的线性范围为109 ～101 pg/ml,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为12.5%和11.9%,高浓度样本批内和批间CV分别为8.3%和9.3%.30名健康献血员样本的PBMC中,83%(25/30)有BAFF-R mRNA表达,范围为0.14～1.03.结论 RFQ -PCR检测BAFF-R mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性.

摘要：目的鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Rv0173中的HLA-A*0201限制性CTL表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测结核杆菌Rv0173中可能存在的HLA-A*0201限制性CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Rv0173的HLA-A*0201限制性CTL表位。结果位于Rv0173氨基酸序列肽3(21-30aa)和抗原肽7(161-170aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体PBMCs增殖,并诱导产生特异性杀伤活性。结论肽3(RLSQSADQYL)(21-30aa)和肽7(LLRGGGLVNL)(161-170aa)是抗原Rv0173上HLA-A*0201限制性CTL的优势表位,可作为结核疫苗设计的候选表位。