摘要：目的:构建同时携带低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF-KGF),观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1αcDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100 MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48h ELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/mL,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/mL。结论:成功构建了腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。