摘要：目的基于质量源于设计(Quality by Design,QbD)理念,开发一种具有较高生物量与较高菌体活力培养特点的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺。方法以不同摇瓶配置为考察因素,菌体悬浮液A600值、培养物湿菌重和菌体活力值为培养结果考察指标,采用方差分析分析培养结果以获得具有高生物量和高菌体活力的第3次扩增摇瓶配置。以摇床温度和摇床转速为试验因子进行2因子2水平全因子试验,菌体悬浮液A值为响应值,培养累计时间为变量因素,摇床实时在线温度与摇床设备自测转速为补充变量因素,采用函数型主成分分析(functional principal component analysis,FPCA)方法进行广义回归,拟合生长曲线模型,通过生长曲线模型获得优化后的培养停止时间及培养工艺,对响应值添加随机噪声蒙特卡洛模拟(Monte Carlo simulation,MCS),再次优化获得摇床培养工艺设计空间,选择设计空间中最劣条件作为验证试验设定条件,以不同培养停止时间分阶段进行连续10批次验证试验。结果第3次扩增摇瓶配置:5 L一次性高效摇瓶,大面积透气膜盖。培养工艺设计空间:摇床温度36.5~37.5℃,摇床转速220~230 r/min,设计培养停止时间18 h。最劣条件验证试验表明,停止培养时间为16 h时,可获得较高菌体活力值且较低生物量的培养结果,停止培养时间为18 h时,可获得较高水平的生物量及菌体活力值。结论本研究设计的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺具有较高生物量及较高菌体活力培养特点,同时可依据此培养工艺适应性调整以满足不同培养需求。

摘要：目的采用人工神经网络(artificial neural network,ANN)优化一种可获得高生物量及菌体活力大肠埃希菌(***)的摇瓶培养基。方法以葡萄糖(glucose,Glu)、酵母浸出物(yeast extract,YE)、酵母蛋白胨(yeast peptone,YP)、大豆蛋白胨(soy peptone,SP)和酵母基础氮源(yeast nitrogen base,YNB)占比为混料分量,菌体悬浮液A_(600)(A1)、培养物湿菌重(G,g/L)和菌体活力指标值(A2,A_(460))为响应值,采用混料设计试验筛选对响应值具有显著影响的混料分量。以混料设计试验结果为训练和验证数据样本构建ANN模型,输入变量为混料分量且约束同混料分量上下限,输出变量为混料设计响应值。通过所构建ANN获得的优化后培养基配方和参考值,应用蒙特卡洛模拟进一步调整培养基配方,并获得***摇瓶培养基配方,再对培养基配方进行10次验证试验。结果***摇瓶培养基配方:Glu 26 g/L、SP26 g/L、YNB 13 g/L,培养基总浓度为65 g/L。验证结果为:培养可获得A1≥14的批次几率为60%,G≥77 g/L的批次几率为50%,A2≥11的批次几率为40%。培养结果数据均值与参考值均等价。结论本研究优化获得的***摇瓶培养基可培养获得高生物量及菌体活力的***。

摘要：目的响应面法优化高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺条件。方法以均质压力(A)、均质次数(B)、均质酵母质量分数(C)3个因素为影响因素,酵母细胞破碎率(Y)为响应值,应用Design-Expert软件,根据Box-Behnken中心组合试验设计方案,用响应曲面法建立二阶数学模型,确定最佳破碎工艺参数,基于二次多项式回归模型建立设计空间,并进行规模化工艺验证。结果方差分析结果显示,模型P0.05,表明模型与检测结果拟合较好。最终获得的操作空间为:均质压力1125~1200 bar,均质次数3~4次,均质酵母质量分数12%。3批重组汉逊酵母细胞发酵液中酵母细胞破碎率均达到65%以上,该值在响应值设计空间范围内。结论响应面法优化的高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺具有较好的稳健性和适应性。

摘要：目的建立EvaGreen qPCR检测牛腺病毒3型(bovine adenovirus 3,BAV3)的方法,用于牛血清等牛源材料的检测。方法依据GenBank公布的BAV3标准毒株WBR-1全基因序列,基于E2B区域高度保守序列设计引物,提取并制备DNA标准品,建立EvaGreen qPCR检测BAV3的方法,并对该方法的特异性、灵敏度及精密度进行验证。最后利用该方法检测牛血清中的BAV3,并与细胞培养法及荧光抗体检测对比,以验证该方法的适用性。结果建立的EvaGreen qPCR检测BAV3的方法标准曲线R^(2)>0.99,扩增效率处于90%~110%,可检测范围为0.2×10^(0)~0.2×10copies/μL。实验内Ct值的CV<2.2%,在不同实验间Ct值的CV<1.8%。设计的BAV3引物与牛腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、副流感病毒3型(parainfluenza virus 3,PI3)、呼肠孤病毒(reovirus,REO)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、狂犬病毒(rabies virus,RV)、羊轮状病毒(Lanzhou lamb rotavirus,LLR)基因组均无交叉反应,特异性良好。采用EvaGreen qPCR对198份新生牛血清进行BAV3检测,阳性检出率为10.1%,检出率高于细胞培养法及荧光抗体检测。结论成功建立了EvaGreen qPCR检测BAV3的方法,该方法快速、灵敏、特异、易于标准化,可用于牛血清中BAV3的检测。

摘要：目的优化b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖活化工艺,提高Hib结合疫苗的产量和质量。方法设计三因素三水平正交试验,考察不同pH、溴化氰加量和活化时间对Hib多糖衍生物、多糖蛋白结合物的影响,依据正交试验结果确定最优的多糖活化工艺,并对该工艺进行放大和验证。结果多糖活化时pH和活化时间对多糖衍生物衍生率及重均分子量(M_(w))均影响显著(P均0.05)。多糖衍生物衍生率和M与多糖蛋白结合物的多糖回收率、多糖与蛋白比值、高分子结合物含量、K_(D)≤0.2的多糖回收率、GMT各指标均显著相关(P均<0.05)。综合多糖蛋白结合物产量、免疫原性及稳定性。确定的最优多糖活化工艺为:在pH 10.5条件下,加入与精制多糖等重的溴化氰反应5 min。结论经优化的多糖活化工艺可以用于Hib多糖蛋白结合物规模化的生产。

摘要：目的以氯化钠溶液为样品和洗脱液,对电导法测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效方法进行验证,确定该方法测定柱效的最优条件。方法设计四因素三水平正交实验对电导法测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效方法进行验证,考察不同样品体积、流速、样品浓度和洗脱液浓度对Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效和对称性的影响。依据正交实验结果确定电导法测定柱效的最优条件并进行验证。结果9次实验测得柱效均>2800 N/m、对称性为1.020~1.160。通过单因素方差分析,样品体积对柱效的影响无统计学意义(P=0.123,P>0.05),对对称性的影响无统计学意义(P=0.735,P>0.05);流速对柱效的影响无统计学意义(P=0.600,P>0.05),对对称性的影响有统计学意义(P=0.032,P0.05),对对称性的影响无统计学意义(P=0.824,P>0.05);洗脱液浓度对柱效的影响无统计学意义(P=0.930,P>0.05),对对称性的影响无统计学意义(P=0.596,P>0.05)。通过极差分析,确定测定柱效的最优条件为:样品体积为600 mL、样品浓度为1.0 mol/L、洗脱液浓度为0.2 mol/L、流速为20 cm/h;重复性和耐用性考察中柱效RSD均0.05)。结论电导法可用于测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效,确定的最优条件重复性、耐用性良好,可准确、真实地评估Sepharose 4FF凝胶层析柱的性能。

摘要：目的开发一种适用于发酵罐手工清洗方法。方法采用组正交超饱和设计方法(15个因素2个水平),试验因素包括9个实际影响发酵罐清洗因素和6个假因素;评价指标为发酵罐清洗后淋洗水电导率与总有机碳(total organic carbon,TOC)含量;通过标准最小二乘法拟合试验结果获得较优清洗条件,从而建立发酵罐手工清洗方法,进而通过试验验证发酵罐淋洗水电导率和TOC含量的实际值是否与预测值具有等效性。结果获得发酵罐手工清洗条件如下:预清洗次数1次,预清洗温度25℃;枸橼酸洗涤浓度5 g/L,枸橼酸洗涤次数1次,枸橼酸清洗温度25℃,酸洗涤剂去除清洗次数1次;氢氧化钠洗涤浓度5 g/L,氢氧化钠洗涤次数3次,碱洗涤剂去除清洗次数5次。验证试验淋洗水电导率和TOC含量检测结果均高于预测值,数据中位数均低于《中华人民共和国药典》2020版(四部)注射用水标准。结论此手工清洗方法对于发酵罐的清洗结果有效,且淋洗水检测结果理想。

摘要：目的 基于质量源于设计(quality by design,QbD)理念优化并验证5型肺炎球菌荚膜多糖层析纯化工艺的设计空间。方法 以样品处理量(sample handling capacity,SHC)、多糖回收率(polysaccharide recovery rate,PRR)为关键质量属性(critical quality attributes,CQAs),通过部分析因试验确定p H、氯化钠浓度、多糖浓度为关键工艺参数(critical process parameters,CPPs),再通过Box-Behnken设计优化CPPs,基于二次多项式回归模型建立设计空间,并进行验证。结果 方差分析结果显示,模型的P均0.05,表明该模型可较好地描述CQAs和CPPs之间的关系。最终获得的操作空间为:pH 7.7~7.9,氯化钠浓度220~280 mmol/L,多糖浓度1~1.6 mg/mL。结论 基于Qb D理念优化的5型肺炎球菌荚膜多糖层析纯化工艺设计空间可提高工艺过程的稳健性和灵活性。

摘要：以单因素和正交实验方法对W135群脑膜炎球菌的摇瓶种子培养条件进行优化。通过单因素试验确定摇瓶种子培养的主要影响因素包括接种量、培养基起始pH和活化菌龄,对以上三个影响因素进行正交实验设计,以培养液菌密度到达OD600值1.1的时间为评价指标,在实验范围内得到影响因素大小顺序为接菌量>起始pH值>活化菌龄,得到最佳培养条件组合是接菌量2.4%,起始pH值7.2,活化菌龄16h。验证试验表明优化的摇瓶种子培养条件可用来进一步完善W135群脑膜炎球菌的培养工艺。

摘要：目的试验设计法优化W135群脑膜炎球菌培养基,以期提高荚膜多糖产量。方法配制流脑半综合培养基(1、2、3号)及改良TSB培养基,以W135群脑膜炎球菌为试验菌株,菌密度为响应值,采用全因子试验、最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析试验对碳氮比进行优化,采用正交试验对硫酸镁、氯化钙、L-胱氨酸、氯化铵、谷氨酸钠、硫酸亚铁6种培养基添加成分进行筛选及优化。结果1号流脑半综合培养基确定为基础培养基;葡萄糖及酸水解酪蛋白为影响菌密度的主效应因素,两者的最适浓度为7.84和10.04 g/L;培养基6种添加成分对W135群脑膜炎球菌生长影响作用大小依次为硫酸镁、L-胱氨酸、硫酸亚铁、氯化铵、氯化钙、谷氨酸钠。优化的1号流脑半综合培养基不仅成分更加简单,且提高了W135群脑膜炎球菌密度。结论优化的培养基增加了W135群脑膜炎球菌密度,为荚膜多糖产量的提高奠定了基础。