摘要：目的:应用多重PCR与毛细管DNA电泳法检测骨髓增殖性肿瘤(MPN)主要致病基因中的JAK2V617F及CALR第九外显子突变,并对该方法的检测性能进行评价。方法:同时设计特异性的JAK2617F等位基因突变PCR引物以及CALR基因第九外显子扩增引物,对引物进行Cy5荧光标记,所有引物在同一PCR反应管中进行扩增,并将PCR产物进行毛细管电泳分析,同时验证该方法的检测限、灵敏度,并与商品化试剂盒进行对比。结果:多重PCR与毛细管电泳技术结合可在一个PCR反应中同时检测JAK2V617F与CALR基因突变,可以在0.01 ng的基因组DNA中检测出JAK2V617F突变,可在0.1 ng的基因组DNA检测出JAK2V617F与CALR双阳性突变,至少可检测出0.1%的JAK2V617F阳性突变,该方法与商品化诊断试剂盒进行对比结果相一致。结论:基于多重PCR与毛细管电泳技术,可在外周血中同时检测JAK2V617F与CLAR基因第九外显子突变,该方法为MPN的诊断提供了新的分子检测手段。

摘要：目的探讨LASS2/TMSG-1基因沉默对PC-3M-2B4细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用机制。方法将实验分为3组:空白对照组(仅转染PBS的PC-3M-2B4细胞)、无关阴性对照siRNA组及LASS2/TMSG-1 siRNA转染组。首先针对LASS2/TMSG-1基因,设计并合成siRNA;在脂质体介导下瞬时转染人前列腺癌PC-3M-2B4细胞24 h后分别采用Western blot和RT-PCR技术检测细胞内LASS2/TMSG-1蛋白及ATP6L mRNA表达水平;使用BCECF AM H+敏感荧光探针检测转染24、36、48、96 h后3组细胞的细胞内H+浓度;用MTT法检测细胞增殖;划痕修复实验和Transwell体外侵袭实验分别检测PC-3M-2B4细胞的迁移和侵袭能力。结果转染LASS2/TMSG-1 siRNA 24 h后,LASS2/TMSG-1 siRNA组LASS2/TMSG-1蛋白表达与对照组相比下降65%,ATP6L mRNA表达水平与对照组比较提高75%。通过BCECF AM荧光探针检测LASS2/TMSG-1 siRNA转染组细胞内H+浓度明显下降,且与空白对照组及无关阴性对照siRNA组相比,差异有统计学意义(P0.05);转染72 h后LASS2/TMSG-1 siRNA转染组细胞生长速度明显升高,与空白对照组、无关阴性对照siRNA组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。划痕修复试验和Transwell体外侵袭实验显示,转染LASS2/TMSG-1 siRNA 24 h后,与空白对照组及无关阴性对照siRNA组相比,能显著促进细胞迁移和侵袭能力(P<0.05)。结论体外合成的siRNA能有效沉默LASS2/TMSG-1基因表达,同时上调V-ATPase质子泵中关键性亚基—ATP6L mRNA的表达水平,且基因沉默后其细胞内H+浓度下降,提示LASS2/TMSG-1基因可能与ATP6L相互作用、共同参与对细胞内pH值的影响,导致肿瘤细胞内外微环境的改变并影响肿瘤细胞的生物学行为,如增殖、迁移及侵袭能力。