摘要：目的克隆内蒙古东部地区科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白2(ancillary protein 2,AP2)基因片段,并进行序列分析。方法根据Gen Bank中登录的牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因序列,使用生物信息学软件Primer 5.0设计1对特异性引物,以内蒙古东部地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,扩增AP2基因片段,与p MD18-T Vector连接,转化至感受态*** JM109中,提取质粒,进行PCR及单、双酶切鉴定;将质粒p MD18-T-AP2转化感受态*** JM109后,利用DNAStar分析测序结果,并对其推导的氨基酸序列进行抗原可及性分析,Prot Scale在线程序分析其疏(亲)水性。结果质粒p MD18-T-AP2经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;扩增的AP2基因序列长度为699 bp,编码233个氨基酸残基,与Gen Bank中登录的无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因核苷酸序列相似性达99%,有3个碱基出现变异(402:C→A;563:C→T;467:A→T),氨基酸序列有两处出现变异,分别为178氨基酸(V→A)和216氨基酸(E→V);该序列二级结构α螺旋分布C-末端较多,β折叠较丰富,分布较均匀,无规则卷曲分布在两端,亲水性指数相对较高,抗原性较好。结论成功克隆出内蒙古东部地区科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因,为进一步研究AP2基因编码蛋白的抗原性奠定了基础。

摘要：目的构建牛乳腺炎无乳链球菌cylE基因缺失突变菌株,为进一步开展其致病机制与免疫机制研究奠定实验基础。 方法参考GenBank上公布的无乳链球菌cylE基因上、下游序列(AF157015.2),利用primer 5.0生物信息软件设计扩增引物,经PCR扩增出cylE基因上游序列L、下游序列R,并根据pACYC184质粒氯霉素抗性基因cat r序列设计引物,扩增cat r基因片段C,依次将L、R和C片段克隆至温敏型自杀质粒pSET4S中,构建cylE基因缺失重组质粒pSET4S-LCR,通过电转化技术将其转化至无乳链球菌,通过温度和抗生素抗性筛选cylE缺失突变株。 结果经PCR和溶血表型鉴定结果表明,成功获得1株牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素cylE基因缺失突变菌株。 结论为进一步研究其致病机制与免疫机制奠定了良好的研究基础。