摘要：为了探究不同组分体外成熟培养基对绵羊卵母细胞体外成熟的影响,试验从健康绵羊卵巢中分离卵丘-卵母细胞复合体(COCs),将分离的COCs分为V-FSH+LH+E_(2)+FBS组、V-FSH+FBS组、V-FSH+LH+E_(2)+BSA组、P-FSH+LH+E_(2)+FBS组、P-FSH+FBS组、P-FSH+LH+E_(2)+BSA组,每组分别添加以V-促卵泡素(FSH,垂体中提纯的FSH)和P-FSH(体外基因重组表达的FSH)为基础设计的体外成熟培养基以进行体外成熟试验,即各组依次添加V-FSH+促黄体素(LH)+雌激素(E_(2))+胎牛血清(FBS)、V-FSH+FBS、V-FSH+LH+E_(2)+牛血清白蛋白(BSA)、P-FSH+LH+E_(2)+FBS、P-FSH+FBS、P-FSH+LH+E_(2)+BSA体外成熟培养基,体外成熟后检测各组卵丘扩展指数(CEI)、第一极体排出率、卵母细胞氧化还原态、乳酸生成量、葡萄糖消耗量、ATP生成量;统计孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数,比较不同组分体外成熟培养基对卵母细胞成熟、代谢及孤雌胚胎发育的影响。结果表明:V-FSH+LH+E_(2)+FBS组CEI最高,除与P-FSH+FBS组差异不显著外(P>0.05),与其他组均差异显著(P0.05)。V-FSH+LH+E_(2)+FBS组、P-FSH+FBS组、P-FSH+LH+E_(2)+BSA组的相对氧化还原比均接近1且差异不显著(P>0.05),但均显著低于其他组(P0.05)外,显著高于其他组(P0.05),但均显著高于其他组(P0.05),但均显著低于其他组(P0.05),但各组的囊胚细胞数差异不显著(P>0.05)。说明不同来源的FSH与不同组分协同作用会对绵羊卵母细胞的成熟、代谢及孤雌胚胎发育产生不同的效果,并影响了其后续胚胎的发育能力。

摘要：旨在探究可变剪接因子核不均一核糖核蛋白F(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F,hnRNPF)对蒙古马精子生成的影响。本研究提取并培养3岁性成熟蒙古马睾丸支持细胞;构建hnRNPF过表达慢病毒载体,将载体转染至蒙古马睾丸支持细胞中;每组3个重复,分别在转染0、24、48、72 h时利用CCK-8检测转染后细胞增殖情况并确定最佳转染时间;提取转染后与未转染的蒙古马睾丸支持细胞RNA,设计已知与精子生成相关基因的引物进行qRT-PCR试验,检测精子生成相关基因在两种细胞中的表达情况。琼脂糖凝胶电泳结果显示,hnRNPF慢病毒过表达载体构建成功;CCK-8检测发现,细胞经过表达慢病毒载体转染72 h后活性最高,并且转染后细胞活性要高于未转染细胞活性,说明hnRNPF过表达会促进蒙古马睾丸支持细胞的增殖;qRT-PCR结果显示,精子生成相关基因(PKMYT1、CDC25C、YWHAZ、BUB1、BTRC、CCNE1、CALM1、PLK1、REC8、MAPK3、ADCY7)在两种细胞中的表达量差异显著,均在转染hnRNPF过表达载体细胞中含量较高。本试验结果表明,剪接因子hnRNPF可能对于蒙古马精子生成具有直接或间接的促进作用,为提高蒙古马精子数量和精液品质提供了新的思路。

摘要：【目的】利用体外培养的绵羊附睾上皮细胞(EECs)探究谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)的抗氧化功能。【方法】体外分离培养并鉴定绵羊EECs后备用。筛选合成3条GPX5的siRNA序列(siRNA-N.1、siRNA-N.2、siRNA-N.3),同时随机设计一段不与GPX5重合的扰码(scramble)序列(siRNA-NC),采用瞬时转染法转染EECs,以正常的EECs为对照(CK),于转染34 h后取样,从mRNA和蛋白水平检测GPX5的干扰效果。采用CCK-8法检测GPX5干扰组、siRNA-NC组和CK组EECs的增殖能力,采用DCFH-DA探针法检测其活性氧(ROS)水平,采用TBA法检测其丙二醛(MDA)水平,采用免疫荧光法检测其8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平。【结果】分离培养的细胞可与角蛋白18(CK18)特异性抗体反应,表明细胞为EECs,可用于后续试验。siRNA-N.3(即siRNA-GPX5)对EECs GPX5 mRNA和蛋白表达的干扰效果最优,可用于后续试验。随着过氧化氢(H_(2)O_(2))处理浓度的增加,与CK组相比,siRNA-GPX5组EECs的增殖能力持续下降。与CK组相比,siRNA-GPX5组EECs中的ROS和MDA水平分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)升高,8-OHdG水平明显上升。【结论】GPX5可以有效保护绵羊EECs,使其免受脂质过氧化损伤及DNA氧化损伤。

摘要：本研究旨在探究内源性绵羊肺腺瘤病毒基因在蒙古羊染色体上的分布情况。参照已登入GenBank中的内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV,登录号为DQ838493)序列,设计合成1对引物,PCR扩增gag基因的部分片段,用地高辛标记制备探针,利用荧光原位杂交(FISH)技术检测enJSRV在蒙古羊染色体上的分布。结果表明,用en-JSRV的gag基因合成的DNA探针在蒙古羊中期分裂相的6条染色体上均有杂交信号,分别为1q45、1p23、2q41、3q23、6q13、9q22和14q25,其中在6和9号染色体上出现有较强的荧光信号。结果提示,在6和9号染色体上这2个位点上有多拷贝的enJSRV基因,1q45、1p23、2q41、3q23、和14q25拷贝数少,这与内源性绵羊肺腺瘤病毒进化有关。

摘要：通过设计和合成TNFRSF1A基因的3条靶向shRNA,并分别插入到pSGU6/GFP/Neo载体中,成功构建出了3个干扰载体,通过脂质体介导法将干扰载体成功转入到内蒙古绒山羊胎儿成纤维细胞中,并利用RealTimePCR检测TNFRSF1A基因的表达量。由结果可知,TNFRSF1A基因的干扰载体经测序鉴定证明构建成功,干扰载体转染内蒙古绒山羊胎儿成纤维细胞24h后可见绿色荧光表达,当到达48h时,转染效率达到最大,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3三组中TNFRSF1A的mRNA表达水平均低于转染空载体的NC组,且shRNA2对TNFRSF1A的mRNA表达具有最佳的干扰效果。综上所述,该研究成功构建了TNFRSF1A干扰载体,为进一步研究绒山羊TNFRSF1A基因在毛囊生长与周期调控的作用奠定基础。

摘要：本试验从内蒙古绒山羊下丘脑中提取总RNA,根据已发表的相近物种MTNR1a序列设计引物,利用逆转录多聚酶链式反应技术及组织原位杂交技术检测褪黑素受体基因MTNR1a在内蒙古绒山羊下丘脑中的表达及其分布,结果显示:MTNR1a基因在内蒙古绒山羊下丘脑中广泛表达,说明下丘脑是褪黑激素作用的靶器官。结果提示:褪黑激素对绒山羊季节性繁殖的影响有可能与下丘脑分泌的某些激素相互作用而发挥其生物学功能的。

摘要：根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(107拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。

摘要：本试验从内蒙古绒山羊脑垂体中提取总RNA,根据已发表的相近物种褪黑激素受体1a(melatonin receptor 1a,MTNR1a)基因序列设计引物,利用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(real-time quantitative,RT-PCR)技术、组织原位杂交技术检测MTNR1a基因在内蒙古绒山羊垂体中的表达。结果显示,通过RT-PCR方法检测到MTNR1a基因在内蒙古绒山羊垂体中表达,利用原位杂交技术进一步确定MTNR1a基因在垂体中表达分布。结果提示,垂体是褪黑激素作用的靶器官,褪黑激素对绒山羊季节性繁殖的影响有可能是与垂体分泌的某些激素相互作用而发挥作用的。

摘要：Hoxc13基因在毛囊形成、毛发生长、毛囊正常形态维持过程中扮演着一个重要角色。为了研究绒山羊Hoxc13的功能,根据GenBank中Hoxc13基因序列设计引物,采用重叠延伸PCR技术,分离并克隆了内蒙古绒山羊Hoxc13基因的cDNA序列,成功构建了该基因的过表达载体pECFP-Hoxc13。