摘要：Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-PCV2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化PCV2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。

摘要：试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBacTM上(含有双启动子),获得含有2个PCV3Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。将该重组质粒转化大肠杆菌DH10-BacTM感受态细胞当中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid P2C,利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救,转染后72h,收取上清病毒液,盲传3代,收取SF9细胞应用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot检测目的蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-P2C酶切验证正确,重组杆粒Bacmid P2C构建成功,杆状病毒中能够表达PCV3Cap蛋白且能与His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定出现特异性绿色荧光,表明成功表达了PCV3Cap蛋白且具有反应原性,为深入开展PCV3抗体制备、新型疫苗研发奠定了基础。

摘要：目的探究下调赖氨酸甲基转移酶2(lysine methyltransferase 2E,KMT2E)蛋白表达对登革Ⅱ型病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)增殖的影响,初步分析KMT2E在DENVⅡ增殖过程中的调控作用。方法针对KMT2E的编码序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染293T细胞以筛选出下调KMT2E表达效率最高的siRNA,并用实时荧光定量分析DENVⅡ在KMT2E表达下调后的增殖情况。结果编号为1的siRNA(siKMT2E-1)有最高的下调KMT2E蛋白表达效率,转染293T细胞后能明显抑制DENVⅡ增殖。结论KMT2E可能在DENVⅡ增殖过程中发挥正调控作用。

摘要：目的建立一种快速鉴别诊断5种重要呼吸道病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒及麻疹病毒)的检测方法。方法基于微流控芯片技术,设计合成针对5种呼吸道病毒的特异性探针引物,利用快速反应体系及创新性温控模块研制的极速荧光定量PCR仪,评估探针引物的特异性、灵敏性及检测体系的重复性,并用临床样本进行测试。结果设计合成的5种病毒的探针引物具有较高的特异性和灵敏性,建立的检测体系可在5min内完成病毒核酸的制备,30min内获得检测结果,且具备良好的重复性。结论建立了5种呼吸道病毒核酸快速定量检测方法,有望用于不明呼吸道病毒感染的鉴别诊断及现场快速检测。