摘要：参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-PCR引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-PCR检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-PCR检测方法.最终建立了AIV系列RT-PCR检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础.

摘要：将人工设计的HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒rFPV-MEGp24大量制备并纯化后,分别在0周、8周、18周肌肉注射至实验恒河猴中,在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周采集血液,分离血清和外周血淋巴细胞（PBMC）,ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量,MTT法测定PBMC的增殖能力,乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性。结果表明：HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒可刺激恒河猴产生HIV-1特异性抗体;免疫猴的PBMC在HIV-1抗原肽刺激下细胞增殖能力加强,针对HIV-1靶细胞的特异性CTL杀伤活性产生,分泌Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2的水平升高。研究提示,HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒能诱导恒河猴产生特异性细胞和体液免疫应答。

摘要：目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达。结论已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。

摘要：针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株）作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因。将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒（FPV）表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子（P7.5）下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18。应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDVVP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础。

摘要：目的:构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法:设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassetteⅡ),在其上下游添加NruⅠ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用NruⅠ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,NruⅠ及BglⅡ/PstⅠ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果:两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论:成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。

摘要：目的构建含非甲基化的CpG ODN序列及霍乱毒素B亚单位(CTB)的HIV复合多表位基因的真核表达载体,并在体外进行表达。方法设计并合成含CpG ODN序列和linker序列的CTB基因引物,用PCR方法扩增CpG-CTB基因(CC),定向连接到真核表达载体pVL上,然后在CC基因下游插入HIV复合多表位基因MEGNp24,构建重组质粒pVL-CC-MEGNp24,酶切鉴定。纯化重组质粒,转染293T细胞,RT-PCR和细胞免疫染色方法分别检测CTB和p24基因的转录及表达,同时设质粒pVL及空白对照。结果构建了重组质粒pVL-CC-MEGNp24,该质粒转染293T细胞后,CTB和复合多表位基因在293T细胞中得到稳定表达。结论成功构建了含免疫佐剂的HIV复合多表位真核表达载体,为后期疫苗的研究奠定了基础。

摘要：研究了hAChE基因在毕赤酵母中的表达。设计并合成引物Pb1和P2,以18周龄引产胎儿大脑组织mRNA为模板,经AMV逆转录和高保真PCR,扩增出序列正确的hAChE成熟肽完整基因约1.8kb,经鉴定获得正确构建的分泌型酵母表达栽体pHIL-S1(hAChE),BglⅡ线性化后回收的酵母表达单位经电穿孔法转化入毕赤酵母GS115中,经MD/MM营养表型筛选、提取酵母基因组进行PCR鉴定和含3-酰基吲哚培养基进行表达产物的显色反应,初步筛选出分泌表达有hAChE活性的***菌22株。依据hAChE酶活性与3-酰基吲哚显色深浅成正比,在平皿和微量反应板上快捷地筛选出高效表达菌pHIL-S1(AChE)(Ⅰ)-7株,SDS-PAGE分析和Western印迹试验表明,产物分子量约为65kDa,经甲醇诱导摇瓶培养,发酵上清原液rhAChE相对酶活性高达4.0mU/ml,表达量占分泌蛋白总量的23.6%。

摘要：构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。

摘要：针对基因4型戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因组ORF3设计特异性引物和探针,建立了一套TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。评价了该方法的准确性和灵敏性,同时与常规RT-PCR和巢式RT-PCR方法进行了对比分析。结果表明,生成的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.994,斜率为-3.312,PCR效率为100%。组内和组间重复性试验相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著,并且能够准确的从HEV阳性猪粪便样品中检测到基因4型HEV RNA,具有较好准确性。可检测到戊型肝炎病毒数量为(1.7×101)copies,比普通RT-PCR的灵敏度高100倍,比Nested RT-PCR高10倍。

摘要：HAART对HIV/AIDS的治疗起到了重要的作用,但研制有效的疫苗是解决该全球性问题的最终方案.将人工设计的HIV-1多表位-p24DNA疫苗质粒pVAX1-MEGp24大量制备并纯化后,于0,4,8及18周肌肉注射免疫恒河猴,分别在第3次免疫和第4次免疫后2周(第10与第20周)采集血液,分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC),乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性,ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量,MTT法测定PBMC的增殖能力.结果表明,HIV-1多表位-p24DNA疫苗免疫组的恒河猴PBMC在恒河猴限制性HIV-1CTL表位肽刺激下产生针对HIV-1靶细胞的特异性杀伤活性,分泌Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2的水平升高,并出现HIV-1特异性细胞增殖反应;该重组疫苗同时能诱导恒河猴产生HIV-1特异性抗体.结果提示,HIV-1多表位-p24DNA疫苗能诱导恒河猴产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.