摘要：目的设计能检测麻疹病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒和小反刍兽疫病毒的基因芯片探针,制备芯片用于以上病毒的种特异性检测。方法在ncbi网站下载上述病毒全部基因组序列信息,利用生物学软件CLUSTAL W对从GenBank中获得的6种病毒所有序列进行比对,获得每种病毒有意义的特异序列,以此作为设计oligo探针的备选序列,利用生物软件Primer Premier 5.0设计探针。选择最优化探针,制备基因芯片,并进行特异性验证。结果获得6条长度均一,退火温度相近,特异性良好的种特异性寡核苷酸探针。结论利用GenBank数据库和生物学软件Primer Premier 5.0设计病毒检测基因芯片探针,是一种快速、有效的方法。

摘要：为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10^(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。

摘要：根据G enB ank中发表的犬瘟热病毒(CDV)的核苷酸序列,设计并合成了扩增CDV H、F和N基因的3对引物,经RT-PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株(LP株)H、F和N基因,并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明,CDV LP株属于强毒谱系,与CDV流行株的亲缘关系近,H基因含有较多潜在的糖基化位点,F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达载体pVAX 1的CM V启动子下游,构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN,体外转染BHK-21细胞,用间接EL ISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠,从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体,初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物,可以激活机体的免疫应答。

摘要：目的:为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病,构建并高效表达中和α毒素(CPA)的特异性双价单链抗体,并对其生物学活性进行初步研究。方法:以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体sc Fv基因为模板,PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或(G4S)3,亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化*** BL21,IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化;Western blot和间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性;通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果:双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正确,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小,Western blot和间接ELISA分析结果显示,构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性,且sc(Fv)2-15与抗原的结合活性明显高于sc(Fv)2-5和sc Fv,体外与体内生物活性试验结果进一步证明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力较sc(Fv)2-5和sc Fv具有明显优势。结论:成功制备了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。

摘要：目的构建产志贺毒素大肠杆菌O138stx2e基因重组质粒,并比较不同型Stx之间的区别。方法根据GenBank发表的stx2e序列设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增从临床分离到的产志贺毒素大肠杆菌O138的stx2e基因,将其克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,而后进行测序。并利用DNASIS序列分析软件对GenBank报道的O22菌株和噬菌体P27的stx2e和O138菌株的stx2e基因序列进行了比较分析,并对O138的stx2e氨基酸残基序列与stx1、stx2和O22菌株stx2e序列进行比较。结果所克隆的O138的stx2e与O22菌株和噬菌体P27的stx2e在碱基序列上同源性达到996%,O138的Stx2e与O22的Stx2e在氨基酸水平上其序列完全相同。Stx2e与stx2的同源性在85%以上,而stx2e与stx1的同源性只有42%左右。结论克隆了stx2e基因,为研究stx2e的结构和功能奠定了基础。

摘要：按金葡菌多重耐药转运蛋白N orA的编码序列设计引物,以金葡菌基因组DNA为模板,扩增出基因norA中约1155bp的cDNA片段,将所得片段与pM D 18-T载体连接,转化到感受态大肠埃希菌JM 109中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒,经N d eⅠ和X hoⅠ酶切,回收1155bp的目的片段,定向克隆到pET-28a(+)表达载体中,转化至感受态大肠埃希菌DH 5α中,提取质粒,再次转化到BL 21(DE 3)中,成功筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出norA部分基因的表达。利用得到的纯化蛋白免疫家兔,并通过间接EL ISA法检测抗体效价,证明得到相应抗体。

摘要：根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响PCR扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 PCR扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV PCR检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于

摘要：用平皿二倍稀释法测定18株表葡菌对环丙沙星的MIC(0.125～128μg/ml)。分别针对表葡菌中gyrA、gyrB、grlA、grlB等四种基因进行引物设计与合成,提取基因组DNA,PCR扩增,对PCR产物进行克隆、鉴定并测序,用DNASIS软件分析测序结果。在表葡菌的GrlA中,只有Ser80→Phe、Ser80→Tyr或Asp84→Asn、Asp84→Ala、Asp84→Tyr的改变。在GyrA中,存在Ser84→Tyr、ser84→Phe、Glu88→Lys的改变;在任一株表葡菌中未见有gyrB或grlB的突变。在被检测的18株临床分离表葡菌中有3个分离株对环丙沙星的MICs≤0.5μg/ml,在GyrA或GrlA的决定区没有变化。对环丙沙星的MICs≥2μg/ml的15个分离株中,GyrA中有Ser84和Glu88及GrlA中的Ser80和Asp84的氨基酸改变。1株MIC为2μg/ml的GrlA中发生一个氨基酸改变,而GyrA中无变化。说明拓朴异构酶IV可能是环丙沙星作用于表葡菌的首要靶位酶。在高水平耐药株中,在GrlA和GyrA中均存在多位点的突变,提示耐药水平的高低与GrlA、GyrA位点的突变直接相关。

摘要：根据狂犬病病毒核蛋白基因保守区序列设计1对引物,建立了用于狂犬病病毒特异性核酸检测的RT-PCR技术。该技术可从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及鼠脑组织中,扩增出443bp的核酸片段,检出核酸的敏感性约为3pg。对30份不同种动物脑组织的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合,但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断,具有快速、简便和敏感的优点。

摘要：通过 PCR条件选择 ,组装了可用于确诊鹅细小病毒 (goose parvovirus,GPV)感染的试剂盒。首先根据 Gen Bank中已发表的鹅细小病毒不同株的核苷酸序列 ,设计并合成了 GPV特异性简并引物 ,利用该引物确定 PCR扩增条件 ,并鉴定了扩增产物的特异性。根据上述扩增条件 ,组装 GPV诊断试剂盒。试剂盒共有 3个反应管 ,贮于 - 2 0℃ ,应用时取 1号管 ,加入煮沸的肝脏悬液上清 ,2、3号管分别为阴性和阳性对照。按固定条件扩增 ,结果显示 ,待检病料的检出率在 96 %以上。该试剂盒操作简单 ,效果稳定 ,可用于