摘要：目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。

摘要：目的为了应对流感流行多亚型并存的局面,进行了多表位核酸疫苗设计,并观察其免疫小鼠的细胞和体液免疫应答反应。方法设计并合成了含有H3、H9的HA和H5N1NA中和表位,M、NP基因保守序列CTL表位的多表位基因盒(Epi)。采用pVAX载体对H5HA、H7HA及Epi进行融合表达。经肌肉注射免疫6～8周龄雌性Balb/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中的针对H3579亚型流感抗体。三免后2周,分离脾淋巴细胞,进行T淋巴细胞转化试验和T淋巴细胞亚类数量检测。结果免疫小鼠获得了针对H3579亚型流感的体液和细胞免疫反应。结论完整HA抗原结合多表位的DNA疫苗模式的成功,预示了该DNA疫苗可能可以有效应对当前多种亚型流感并存的局面,并为其他种类流感疫苗的研究奠定了基础。

摘要：目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。

摘要：目的:在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法:选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果:支原体PCR产物大小约为288bp,质粒质量浓度为13.9mg·mL-1,A260/A280(Ratio)为1.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝.μL-1。10μmol.L-1的引物浓度和10μmol.L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式:Ct=-2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论:支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。

摘要：目的以CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA重组质粒（pCTN-GFP）和HEP-Flury株病毒N、P、L辅助质粒共转染拯救具有活性的CTN株重组狂犬病病毒（CTN-GFP）。方法将CTN株狂犬病病毒全长基因组分4段进行扩增，体外连接扩增片段并克隆人表达载体中，构建CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA重组质粒，基因组ψ基因被标识基因GFP取代，通过与HEP-Flury株病毒N、P、L3个辅助质粒共转染BHK-21细胞，拯救能够稳定表达GFP的重组病毒CTN-GFP。结果成功扩增全长基因组的4个基因片段，并将其克隆入表达载体，构建了CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA重组质粒pCTN-GFP，经酶切鉴定和序列测定证明pCTN-GFP为正确克隆，可直接用于病毒拯救。将pCTN-GFP与HEP-Flury株病毒辅助质粒共转染BHK-21细胞4d后，成功拯救出CTN株重组狂犬病病毒，重组病毒能够表达标识基因GFP，荧光显微镜下可直接观察到标识基因GFP的表达，设计跨GFP和L基因的特性引物对重组病毒进行RT-PCR检测，结果证明此病毒是从克隆的质粒中拯救的重组病毒。结论HEP-Flury株病毒的结构蛋白能够包装并转录CTN株病毒的基因组RNA。

摘要：目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。

摘要：根据鸡九次跨膜超家族成员2(chicken transmembrane 9 superfamily 2,chTM9SF2)预测序列设计引物,以原代鸡胚成纤维细胞CEF、鸡成纤维细胞系DF1和鸡肝癌细胞LMH的cDNA为模板,采用PCR方法扩增chTM9SF2编码序列,并利用MEGA 7.0、Clustal W、SWISS-MODEL等生物信息学工具对鸡、鸭、人、鼠等不同物种来源的九次跨膜超家族成员2(transmembrane 9 superfamily 2,TM9SF2)进行遗传进化、同源性、结构域及结构模拟等分析;进而通过构建真核表达质粒,利用Western blot、激光共聚焦显微镜探究chTM9SF2的表达和亚细胞定位。结果显示,分别在3类细胞中均可成功获得编码序列一致的chTM9SF2基因,与禽类的同源性最高,且高度保守;该基因能够在DF-1细胞中表达,且主要定位于晚期内体或溶酶体膜。结果表明,成功扩增获得chTM9SF2基因,并在DF-1细胞成功表达,分析其定位于晚期内体或溶酶体膜,为进一步研究chTM9SF2的生理功能及在病原感染中的作用奠定了基础。

摘要：目的建立口蹄疫病毒(FMDV)Asia1型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法。方法在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asia1型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件,并进行特异性及相关病毒检测。结果优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好,检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致。结论已建立了FMDVAsia1型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础。