摘要：目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 。

摘要：根据登革 2型病毒衣壳蛋白C基因和葡萄球菌核酸酶SN基因序列设计引物 ,从构建的原核表达载体pLEX D2C SN中扩增获得编码登革病毒衣壳蛋白和葡萄球菌核酸酶的融合基因D2C SN ,将其插入到真核表达载体pcDNA6 V5 His中 ,筛选获得重组质粒pcDNA D2C SN .电穿孔转染BHK细胞后 ,5mg Lblasticidin压力筛选 ,通过RT PCR、间接免疫荧光和免疫印迹鉴定表达的蛋白 ,体外DNA消化试验检测核酸酶活性 .结果表明 ,融合蛋白D2C SN在BHK细胞中获得了稳定表达 ,表达的融合蛋白能够被抗登革病毒衣壳蛋白的单克隆抗体特异识别 ,并具有良好的核酸酶活性 ,能够对DNA进行切割 .同时 ,BHK细胞中稳定表达的融合蛋白D2C SN能够有效抑制登革病毒的增殖 ,使其感染性降低 10 3 ～ 10 4倍 .

摘要：目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。

摘要：目的　构建我国登革 2型病毒 43株基因组全长cDNA ,为进一步研究其体外RNA转录产物的感染性 ,阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法　根据登革 2型病毒参考株NGC株的核苷酸序列 ,利用DNASTAR软件设计覆盖登革 2型病毒 43株基因组的 6对重叠引物。从感染登革 2型病毒 43株的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA ,采用RT PCR分别扩增 6条基因片段 ,并将其分别与pGEM T载体进行连接。重组质粒用PCR进行快速鉴定 ,并在 377A型自动测序仪进行序列分析。然后利用单一酶切位点 ,分别自阳性重组子上切下各基因片段 ,在体外分别进行 5′半分子和 3′半分子的连接 ,最后将 5′和 3′半分子连接成基因组全长的cDNA。扩增各接头两侧长约 45 7～ 6 91bp的基因片段 ,连接至T载体后测序 ,从而对全长cDNA进行鉴定。结果　共扩增出 6条约 1 5～ 2 5kb的基因片段 ,并在体外进行连接 ,获得了全长cDNA。结论　通过测序证实成功地构建了我国登革 2型病毒 43株基因组全长cDNA分子。本研究结果将为阐明我国登革病毒株的毒力及致病机理奠定基础。

摘要：目的利用LightCycler建立一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法,用于炭疽芽孢杆菌的快速检测。方法采用SYBR GreenⅠ随机掺入法,利用本实验室建立的实时荧光定量PCR反应体系,根据炭疽芽孢杆菌荚膜和水肿因子设计引物,同时检测两个毒力相关质粒的存在,检测其灵敏度和特异性,并以盲测试验进行验证;在此基础上鉴定14株炭疽芽孢杆菌,并测试该法检测土壤模拟污染标本的灵敏度,实验中设置内对照以排除假阴性结果的存在。结果炭疽杆菌基因组DNA的检测灵敏度可达每反应体系0.53pg,两个克隆株提取质粒的检测限分别为每反应体系12拷贝、140拷贝;检测14株炭疽芽孢杆菌及29株非炭疽芽孢杆菌的PCR扩增结果表明,炭疽芽孢菌DNA均出现特异的扩增结果,29株对照菌的DNA均为阴性;土壤模拟污染标本检测灵敏度可达每反应体系36个芽孢;20次重复实验结果表明其平均值与标准差为14.602±0.640。结论该方法检测炭疽芽孢杆菌具有简便、快捷、灵敏度高和特异性好的特点,为临床诊断、环境监测、卫生防疫等方面,快速检出炭疽芽孢杆菌提供了有利的手段。

摘要：根据汉坦病毒Ｈ８２０５株ＮＰ基因的序列，设计一对引物，扩增ＮＰ前２９２个氨基酸多肽基因片段，克隆于表达载体ｐＧＥＸ３Ｘ，与载体中２６ｋＤ的谷胱苷肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达。ＳＤＳＰＡＧＥ显示表达产物（ＧＳＴＮＰ）主要以包涵体形式存在。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ表明此融合蛋白有抗原性。包涵体经分离、洗涤、溶解后，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ层析纯化，用此融合蛋白作抗原，进行ＥＬＩＳＡ法检测临床ＨＦＲＳ病人标本的ＩｇＧ和ＩｇＭ，有很好的特异性和敏感性。有生物活性的汉坦病毒Ｈ８２０５ＮＰ的体外表达成功，为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础，也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。

摘要：目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果　得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论　随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。

摘要：目的初步建立肠出血性大肠杆菌O157的聚合酶链式反应-免疫层析检测(PCR-ICT)技术。方法根据肠出血性大肠杆菌O157的溶血性基因(hlyAB)序列设计特异性引物和探针,并分别经生物素和地高辛标记,用胶体金免疫层析技术检测PCR扩增产物。结果用建立的PCR-ICT方法检测5株O157H7血清型大肠杆菌均得到阳性结果,检测5株非O157血清型普通大肠杆菌和5株其他肠杆菌菌株均得到阴性结果,检测冻虾仁、冻贝肉、冻鸡肉、冻猪肉等出口食品样品43份,未检出肠出血性大肠杆菌O157,与PCR-凝胶电泳和分离培养法检测结果一致。结论用金标免疫层析方法检测PCR产物,其灵敏度基本与电泳法相当。初步应用表明PCR-ICT方法简便具有快速、易操作、检测时间短、简便等特点。

摘要：目的基于N-糖基化部分改造毕赤酵母构建表达分泌型人全长抗体库。方法基于酵母分泌型表达载体pPICZαA构建双启动子串联表达重链和轻链恒定区基因的载体pPICZαA-C H-C L,经基因序列分析和Western blot分析验证。设计44对简并引物经逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增获得轻链可变区V L和重链可变区V H基因库。通过PCR将其插入上述恒定区表达载体构建全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L。将该库电转化N-糖基化部分改造后宿主菌株GS115Y。随机挑取20个平板克隆进行菌液PCR鉴定、基因分析,并提交IgBLAST-imgt数据库鉴定抗体库正确性与多样性。结果获得表达重链和轻链恒定区的表达载体pPICZαA-C H-C L,并在此基础上初步获得全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L,库容量为105。结论成功构建了分泌型N-糖基化毕赤酵母人全长抗体库。

摘要：目的　利用PCR指纹图技术筛选细菌种特异性探针 ,探索利用PCR指纹图技术实现病原菌通用检测的可能性。方法　以鼠疫耶尔森菌为实验对象 ,利用REP 1和REP 2引物对在非严谨的条件下进行PCR指纹图扩增 ;将所有扩增片段纯化后 ,克隆至pGEM T载体 ,转化大肠杆菌JM10 9;用生物素化的载体引物扩增克隆化片段 ,进行末端标记 ;在硝酸纤维素膜上固定鼠疫杆菌的染色体DNA以及相应对照菌株的染色体DNA ,以末端标记的扩增产物进行杂交 ,通过生物素 链霉亲和素 辣根过氧化物酶系统显色 ,判断扩增片段的特异性。结果　经杂交筛选 ,发现 1个长度约为 90 0bp的扩增具有较好的杂交特异性片段 ,将序列与鼠疫耶尔森菌已完成的基因组序列比较 ,仅发现 4个核苷酸的差异 ;根据这段序列设计的引物对可以特异性地扩增鼠疫耶尔森菌的模板。结论　利用PCR指纹图技术成功筛选到一段鼠疫耶尔森菌的种特异性探针 ,为细菌通用检测技术的研究开辟了新的思路。