摘要：目的验证新获得的鹦鹉热衣原体HSP60基因在***中高效表达的产物是否具有足够的抗原活性,为进一步研究其在鹦鹉热衣原体感染检测上的应用奠定基础。方法根据GenBank鹦鹉热衣原体Hsp60基因序列X51404,设计一对特异性引物,扩增了鹦鹉热衣原体HSP60全长基因,克隆入pET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增了鹦鹉热衣原体HSP60全长基因,表达产物分子量约为68kD,经Western blotting和胶体金免疫层析技术检测,表明表达产物具有较好的抗原性。结论扩增了鹦鹉热衣原体HSP60全长基因,并对其表达产物的抗原性进行免疫印记分析和免疫层析初步检测,表明具有较好的抗原性,为进一步研究其在鹦鹉热衣原体感染检测上的意义打下了基础。

摘要：目的确认贝氏柯克斯体特异的核酸标识。方法用PCR法特异扩增贝氏柯克斯体24kDa,27kDa、30kDa、34kDa、热休克蛋白B等表面蛋白基因,以及23SrRNA插入序列和16S23SrRNA间区序列等基因片段,从DNA电泳凝胶中回收纯化PCR扩增的目的DNA片段,用地高辛随机引物标记法标记目的DNA片段作探针,行DNA斑点杂交。结果PCR扩得的7个贝氏柯克斯体DNA片段探针只能与贝氏柯克斯体基因组DNA杂交而不能与其他种属的立克次体的基因组杂交,每种探针检测同源目的基因的灵敏度可达到10pg。结论这7种贝氏柯克斯体DNA片段是贝氏柯克斯体特异的DNA片段,可作为贝氏柯克斯体的核酸标识,基于它们的序列设计的引物和探针具有极高的贝氏柯克斯体种特异性。

摘要：目的：对一株从中国河南省一名艾滋病患者体内分离的、可在MT4细胞上稳定传代的未知病毒29A进行鉴定，确定该病毒种类及型别。方法：用从该患者外周血单核细胞中分离的病毒株感染MT4细胞，获得可在该细胞上稳定传代的病毒株29A。通过细胞病变特征、电镜观察结果、HIV-1 p24抗原检测以及HIV-1 pol区基因扩增结果，对该毒株是否为HIV-1进行鉴别。在电镜下对病毒感染细胞的超薄切片进行观察，发现该病毒呈现疱疹病毒形态特征，因此设计人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66三个不同基因片段的特异性引物并进行巢式PCR扩增，对扩增产物进行序列测定和结果分析。结果：该毒株HIV-1 p24抗原检测为阴性；用HIV-1 pol区特异性引物未扩增出目的片段；细胞病变形态不同于HIV-1引起的病变；电镜观察该病毒直径为160～200nm，明显大于HIV—1，表明该传代株不是HIV-1。用人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66等基因的特异性引物均扩增出了目的片段，序列分析的结果表明该毒株为HHV-6病毒B亚型。结论：在国内首次从艾滋病患者的外周血淋巴细胞中分离出HHV-6，为进一步研究HHV-6和HIV-1的相互作用奠定了基础。

摘要：目的采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR。方法依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出<10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1000倍。用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性。用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性。结论该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒。

摘要：目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。

摘要：目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础。方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pW SK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒。进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定。结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性。

摘要：目的:构建SNAP-25基因的原核表达载体pET22b-SNAP-25,对表达产物活性进行初步鉴定。方法:根据GenBank中已报道的SNAP-25基因序列,设计特异引物,通过RT-PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到基因。将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中,重组质粒转化大肠杆菌***21感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析进行纯化。通过SDS-PAGE和免疫印迹对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析。结果与结论:成功构建了原核表达载体pET22b-SNAP-25,Western印迹证实重组蛋白获得表达。表达的重组蛋白与A型肉毒毒素混合反应,经SDS-PAGE验证,重组蛋白具有被毒素特异性切割的活性。

摘要：目的:对近年来国内外重要的生物恐怖袭击应对处置演习进行分析和总结,为生物袭击应对准备和处置能力建设提供借鉴。方法:收集演习事例,归纳分析演习情景设置中所用的生物剂种类和袭击类型、演习产生的效果及其存在的问题;总结演习的类型及其特点,以及不同类型演习对生物恐怖袭击应对准备和处置能力的检验作用等。结果与结论:要做好生物袭击事件应对处置能力准备,生物袭击应对处置演习在检验、磨合、培训环节发挥着重要的作用。在组织、检验应对处置能力准备演习时要根据演习检验的目标,设计好演习情景想定并选择适当的演习类型。

摘要：目的:表达蓖麻毒素B(RTB)链蛋白,为制备RTB特异性抗体奠定基础。方法:采用密码子优化软件对RTB编码基因序列重新优化设计,以18条长片段寡核苷酸引物经两步重叠PCR合成RTB基因片段,并在RTB的C端引入6×H is标签序列,插入表达载体pBV220,转化***5α获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用W estern印迹和间接ELISA方法鉴定重组RTB蛋白的抗原性。结果:表达工程菌株***5α在42℃经诱导3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的65.48%,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTB相对分子质量相符,为29×103左右。表达产物经N i-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达96.21%,并可得到约25 mg/L重组RTB蛋白。结论:在国内首次应用重叠PCR合成RTB基因并实现高表达,纯化重组RTB蛋白可被抗天然蓖麻毒素多抗所识别,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了基础。

摘要：目的筛选与贝氏柯克斯体感染血清反应的贝氏柯克斯体毒力相关蛋白。方法以贝氏柯克斯体标准株九里株为模板,采用PCR扩增包括IV型分泌系统、分泌性蛋白和膜蛋白在内的毒力及毒力相关的基因,将扩得目的基因片段与原核表达质粒pET32a重组,将重组质粒转化大肠杆菌,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转化大肠杆菌作免疫印迹。结果设计173对引物共扩增出170个目的基因,经PCR及酶切鉴定,有155个基因与pET32a质粒重组成功,SDS-PAGE电泳分析发现,共有104个转化菌表达目的蛋白,在104个重组蛋白中,筛选到32个与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的重组蛋白。结论这些与贝氏柯克斯体感染血清反应的毒力相关蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。