摘要：目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。

摘要：目的研究温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控作用。方法首先设计相关跨基因引物,用RT-PCR方法验证psa位点的相关操纵子结构。扩增操纵子首基因上游启动子区500 nt序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,将重组质粒转入鼠疫菌中,通过测定β-半乳糖苷酶活性差异来判断不同温度(26和37℃)和酸度(pH 6.0和pH 8.0)对psaE和psaA的调控关系。最后提取鼠疫菌在上述不同温度和酸度条件下的总RNA,采用引物延伸实验进一步明确温度和酸度对psaA的调控关系。结果与结论 RT-PCR结果证实了田鼠型鼠疫菌的psa位点由操纵子psaEF和psaABC构成;半乳糖苷酶和引物延伸实验结果显示在37℃、pH 6.0培养条件下psaABC的转录水平最高,而psaEF的转录水平无明显变化,提示psaA的表达水平在37℃酸性条件下表达量最高,psaE则不受温度和酸度的调控。

摘要：目的建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法。方法通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响。结果五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增。结论建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测。

摘要：基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。优化设计合成溶葡球菌酶序列,构建重组表达载体pQE30-Lys,转化至大肠杆菌M15并诱导表达,镍柱纯化得到目的蛋白。利用重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法特异定量检测金黄色葡萄球菌并与平板计数对比。成功表达了重组溶葡球菌酶,并建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法,与平板计数具有显著线性关系。本研究建立的将重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法相结合的检测方法操作快捷简单,具有良好的应用前景。

摘要：以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变.构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为:pAB121-PB1,pAB122-PB2,pAB123-PA,pAB124-HA,pAB125-NP,pAB126-NA,pAB127-M和pAB128-NS.在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B.该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/***-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512.实验结果暗示:从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型.

摘要：建立多重PCR反应结合基因芯片技术的11种(株)食源性致病菌检测方法。以金黄色葡萄球菌、志贺菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌等11种(株)食源性细菌的特异性基因为靶基因,利用Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计引物和探针,BLAST比对分析特异性。寡核苷酸探针点制醛基玻片制备基因芯片,13对引物分为3组扩增,PCR产物混合后与基因芯片杂交检测。鼠伤寒沙门菌、产气荚膜梭菌、奇异变形杆菌等11种(株)细菌使用该方法检测均能准确鉴定,基因组DNA灵敏度为10-100 pg,6组模拟DNA混合样本芯片检测结果与预期一致,18株沙门菌临床分离株检测均为阳性。从样本PCR扩增开始至检测完成,整个操作时间不超过3 h。该方法能够对11种(株)食源性致病菌快速准确鉴定,可以满足部分食源性致病菌通量检测的要求,具有较好的临床应用前景。

摘要：目的了解鼠类自然感染汉坦病毒(HV)时间动态变化。方法选取北京昌平南口镇某部驻地,从2002年8月至2004年5月采用夹夜法捕获鼠形动物,针对汉坦病毒M基因部分片段设计SEOV和HTNV型特异性引物,应用RT-PCR法检测宿主肺组织中携带HV-RNA及其型别情况;应用ELISA法和间接IFAT检测IgG抗体。利用SPSS软件分析宿主动物HV感染的时间动态特征。结果共捕获啮齿动物296只,平均感染率11%。整个调查周期总体宿主种群密度波动不大,局部小生境(养殖场)种群波动明显。优势宿主褐家鼠平均种群密度与其感染率变化之间具相关性(r=0.594,P=0.023),养殖场褐家鼠密度与HV感染率之间相关性极显著(r=0.746,P=0.008)。褐家鼠性比和阳性率变化之间不具统计学意义相关性(r=0.541,P=0.086)。成幼比和阳性率变化之间则具显著相关性(r=0.697,P=0.046)。结论北京昌平鼠间汉坦病毒感染长期持续存在,其感染率与种群密度随时间呈现动态变化,两者之间具有相关性,并因生境而异。优势宿主种群结构特征及其动态变化与HV感染也存在较为复杂的关系。

摘要：目的:扩增猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)05Z33中的mrp基因,并在大肠杆菌BL21中重组表达,以获得高纯度的重组MRP截短蛋白,验证其抗原保护性。方法:以05ZYH33基因组为模板并设计引物扩增目的片段,构建表达质粒,利用亲和层析对目的蛋白进行纯化,免疫新西兰大白兔制备抗血清并测其效价。通过抗原保护实验及抗血清调理的全血杀伤实验验证重组MRP蛋白抗原保护性。结果:重组MRP蛋白在大肠杆菌中高浓度表达,纯化获得了高纯度的MRP截短蛋白并制备获得了抗血清。经该蛋白免疫过的CD-1小鼠与阴性对照组相比,存活率显著升高。经抗血清调理后,野生株05ZYH33在全血中的存活率显著降低,突变株ΔMRP无显著变化。结论:MRP蛋白有较高的抗原保护性。

摘要：噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。噬菌体在生态、微生物进化、细菌性疾病预防和治疗、细菌鉴定与疾病诊断等方面扮演重要角色。基因组测序技术和高效合成平台促进了合成基因组学的发展。利用合成基因组学技术,对噬菌体基因组进行设计或者合成出新的噬菌体来服务人类在不久的未来可能成为现实。但与此同时,合成噬菌体带来的风险也必须认真考虑。

摘要：目的建立一种可以同时检测人类A型流感病毒,B型流感病毒及A型流感病毒H1,H3,H5亚型的多重RT-PCR方法。方法根据人类流感病毒的特异性基因设计并合成多对特异性引物,建立可同时扩增出人类流感病毒亚型特异性片段的多重PCR的方法。同时,对该方法的特异性和敏感性进行了评价,并利用该方法对39份疑似swineH1N1的临床标本进行检测。结果该方法可同时扩增出A型流感病毒M基因203bp,B型流感病毒M基因296bp,A型流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为362bp(H1),112bp(H3),188bp(H5),494bp(swineH1)。该实验最低可检测新甲型H1N1(A/Beijing/501/2009)病毒RNA0.5TCID50。该方法的特异性实验结果显示,在多重PCR检测中未检出非特异扩增的PCR产物。同时,使用该方法从39份疑似新甲型H1N1的临床咽拭子标本中检测出新甲型H1N1阳性的标本4份(10.2%),季节性H1N1亚型2份(5.1%),H3N2亚型12份30.7%,本次实验结果与WHO通过实时PCR方法检测的结果一致。结论本研究建立的多重PT-PCR方法快速、敏感,特异性强,可用于人类流感病毒的分型检测。