摘要：目的研制肺炎克雷伯菌(KP)全基因组DNA芯片并对芯片质量进行评价。方法根据KP的NTUH-K2044全基因组序列,挑选出5075条基因,PCR扩增各基因并纯化产物,点样制备芯片。设计了3个质控杂交组合,采用双色荧光杂交策略,对芯片质量进行评价。结果与结论芯片杂交结果与理论预期结果一致。本研究成功研制了KP全基因组DNA芯片,并建立了基于全基因组DNA芯片的KP比较基因组学技术平台。

摘要：目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值<15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。

摘要：在此实验中，设计了一种包含2种成分的重组融合蛋白作为疫苗成分来防护鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia）可能产生的生物威胁．重组F1-V蛋白与铝佐剂结合，分别以10，20，50μg剂量免疫BALB／C小鼠，周期为2个月．检测小鼠血清抗体水平和T辅助细胞的亚型．免疫后小鼠以25～600LD50剂量的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒实验．结果证明，F1—V重组蛋白在小鼠体内诱导产生足够保护的免疫应答．血清IgG水平是产生最终保护力的一个重要因素．20μg的免疫剂量可以诱导血清抗体效价高达51200，使小鼠对400LD50的鼠疫耶尔森氏菌产生100％的保护．F1—V重组蛋白引发的抗体亚型主要为IgG1类，说明抗体反应趋向Th2型反应．流式细胞分析表明，铝佐剂主要帮助F1—V重组融合蛋白诱导强烈的体液免疫而不是CTL细胞免疫应答．表明F1—V重组亚单位疫苗株有希望成为一种新型的鼠疫疫苗候选株．

摘要：目的研究钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32与致病性钩体抗体的免疫反应性以及与不同钩体血清群之间的交叉反应性,为钩体病的血清学检测提供抗原。方法依据黄疸出血群赖型56601株外膜脂蛋白LipL32基因序列设计引物,扩增出该基因片段DNA,将其克隆至表达载体pET-28a中。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21并诱导表达,表达的重组蛋白纯化后采用Western blotting评价其与56601株及其他14个血清群致病性钩端螺旋体抗体的免疫反应性和交叉反应能力。结果扩增获得了56601株脂蛋白LipL32基因,成功构建了原核表达重组质粒pET28a-LipL32。重组蛋白rLipL32为包涵体表达,且与56601株及另外14个血清群的致病性钩端螺旋体的兔抗体发生了特异性免疫反应。结论原核表达重组外膜脂蛋白rLipL32在致病性钩体血清群之间有良好的交叉反应能力,可初步作为属范围内的钩端螺旋体抗体检测候选抗原。

摘要：目的了解北京城区中心地带鼠间汉坦病毒(HV)感染状况及其病毒型别差异。方法选取北京城区某方圆约1km两街区之内的食物资源丰富、场所隐蔽的中、小餐饮行业、蔬菜集贸市场及周边垃圾堆、卫生死角等生态环境,从2003年12月至2004年11月每月连续采用夹夜法捕鼠,计算鼠密度和鼠种构成。应用间接ELISA法检测鼠血清IgG抗体;针对汉坦病毒M基因部分片段设计汉城型汉坦病毒(SEOV)特异性引物,应用RTPCR法检测宿主动物携带HV情况,阳性标本直接测序。利用Excel和SPSS软件分析宿主动物HV感染的动态特征。最后用DNASTAR软件对获得序列进行比较分析。结果共捕获啮齿动物229只,平均鼠密度6.41%(229/3570),褐家鼠和小家鼠分别为餐饮业、农贸市场生境的优势鼠种。褐家鼠血清抗体阳性率3.51%(6/171),带病毒率为0.58%(1/171);小家鼠血清抗体阳性率为6.90%(4/58),带病毒率为1.72%(1/58)。病毒检出率以11、12月最高,抗体水平冬春季(1、4月)最高,与春季人群肾综合征出血热(HFRS)流行季节基本一致。2份扩增阳性标本(分别来源于小家鼠和褐家鼠)均为SEOV,差异为5.40%,系统发育分析显示他们位于2个不同的较小分支,但均位于Z37支系。结论北京城区2种主要的HV宿主在一些鼠害重点行业密度仍较高,虽然HV基础感染率不高,但持续存在,为春季人群HFRS发病高峰的重要影响因素。来自2个不同宿主的HV基因有一定的差异。小家鼠的传播作用有所加强,应予重视。

摘要：目的:利用分子生物学实验研究肺炎克雷伯菌环磷酸腺苷受体蛋白(cAMP receptor protein,CRP)对kfuABC操纵子的转录调控机制。方法:设计相关跨基因引物,用Real-time PCR方法验证kfuABC的转录结构。以肺炎克雷伯菌野生株NTUHK2044(wild type,WT)的总RNA为模板,利用引物延伸的方法寻找kfuA的转录起始位点,确定其核心启动子区。构建含kfuA启动子区DNA序列的LacZ重组质粒,并将其转入突变株△crp(肺炎克雷伯菌野生株基因组中crp基因敲除)和WT中,通过测定比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来判定CRP调控子对kfuA的调控关系;分别提取△crp和WT的总RNA,进一步采用实时定量Real-time PCR的方法验证CRP对kfuA的调控关系。通过凝胶阻滞实验验证His-CRP是否对kfuA启动子区具有直接的结合作用,进一步采用DNaseⅠ足迹实验确定具体的结合位点。结果:肺炎克雷伯菌kfuA、kfuB和kfuC位于同一个操纵子kfuABC;引物延伸实验结果显示kfuABC只有一个转录起始位点T;CRP能够结合到kfuABC启动子区-204到-171之间的碱基序列上(转录起始位点为+1),抑制其转录表达。结论:CRP能直接结合到kfuABC启动子区抑制其转录表达。

摘要：背景:骨髓干细胞能够修复受损心肌,改善不利的心室重构及恶化的心功能,但细胞移植后对梗死心室重构影响的分子机制仍不清楚。目的:观察骨髓单个核细胞心肌移植后,心肌组织NF-κB、基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的变化。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-05在解放军总医院心血管外科实验动物中心和解放军军事医学科学院病原微生物生物安全国家重点实验室完成。材料:成年健康雄性杂种犬24只,随机分为急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组,6只/组。方法:急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组在冠状动脉左前降支主干结扎1h,观察缺血梗死区仍然呈暗红色,确认急性心肌梗死模型建立成功。陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组在移植前行超声心动图检查,证实左室前壁和心尖部可见节段性室壁运动异常,确认陈旧心肌梗死模型建立成功。Ficoll分离法获得犬自体骨髓单个核细胞悬液,急性心肌梗死移植组在造模后1h于梗死区及梗死边缘区分多点注射细胞悬液,每点注射0.5mL,(1～2)×107个细胞/mL;陈旧心肌梗死移植组于造模后4周开胸确认梗死区,同法行细胞移植。主要观察指标:RT-PCR法检测心肌组织基质金属蛋白酶及其抑制因子mRNA的表达,Western免疫印迹法检测心肌组织NF-κB的表达。结果:移植后6周与相应对照组比较,急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死移植组的梗死区、梗死周围区基质金属蛋白酶2,9mRNA及NF-κB表达均显著降低(P<0.01),基质金属蛋白酶抑制因子1,2mRNA表达均显著升高(P<0.01)。结论:犬自体骨髓单个核细胞心肌移植可能通过抑制NF-κB活化,导致基质金属蛋白酶mRNA表达减少及其抑制因子mRNA表达增加,从而抑制梗死后心室重构过程。

摘要：目的探讨某部肾综合征出血热(HFRS)的流行状况、啮齿动物间汉坦病毒(HV)感染特点及HV基因型,为HFRS的预防控制提供科学依据。方法夹夜法捕鼠,计算鼠密度,确定鼠种构成。针对HV基因M片段部分序列设计2种型特异性引物,应用RTPCR法检测宿主动物带病毒情况。结果共捕获宿主动物14只,血清抗体阳性率为21.43%,RTPCR扩增检测出阳性标本1份,为褐家鼠,分型为汉城型阳性标本。密切接触人群血清抗体阳性率为3.64%。结论该地区存在汉城型HV感染,提示应加强疫情监测,防止疫情的扩大蔓延。

摘要：目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体(Ot)情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性。方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定。结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带。对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份(LHGM2株)为Karp型。序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果:XDM2株首轮PCR产物碱基序列与。Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97．00％,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型; LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96．45％,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型。结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型。

摘要：人工设计合成规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)序列特异性引物,将从临床分离的大肠埃希菌株作为模板,采用PCR扩增方法筛选含有CRISPR系统的大肠埃希菌;利用噬菌斑法从医院未经消毒处理的污水中分离大肠埃希菌噬菌体,经过PEG沉淀的方法浓缩得到高滴度的噬菌体,再用该筛选噬菌体感染上述含有CRISPR的大肠埃希菌以筛选耐受该噬菌体的大肠埃希菌菌株。最后从70株大肠埃希菌中筛选到42株含有CRISPR序列的菌株,然后采用噬菌斑法分离到1株大肠埃希菌*** 147-30的裂解性噬菌体IME-EC1,在此基础上利用*** 147-30筛选到1株耐受噬菌体IME-EC1的大肠埃希菌菌株,命名为*** 147-30R1。