摘要：目的通过毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备重组人凝血酶原2(prothrombin-2),并利用锯鳞蝰(Echis carinatus)凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据Gen Bank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体p PICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3.1(+),瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺(pNA),且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。

摘要：目的通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H(endo-beta-N-acetylglucosaminidase H,Endo-H),并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至***表达载体pPIC9中,重组质粒转化*** JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可>95%。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳(DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis,DSA-FACE)分析核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNaseB)的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F(peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F)的糖基切割功能。结果利用***表达制备EndoH,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSAFACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5GlcNAc-Man9GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5GlcNAc2-Man9GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过***制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。