摘要：在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。

摘要：目的:从丝瓜籽中克隆核糖体失活蛋白luffin-a基因,并在原核系统进行表达。方法:根据已报道的cDNA序列设计引物,用RT-PCR的方法从成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-28 a(+)-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。利用金属离子亲和层析的方法纯化所得目的蛋白。结果:克隆的luffin-a基因及其所编码的氨基酸序列与国外报道的核苷酸序列及氨基酸序列同源性分别为95%和92%,因而所获得的luffin-a基因是丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a一个新的cDNA序列。经SDS-PAGE分析:luffin-a主要存在于包涵体中。金属离子亲和层析可纯化目的蛋白。结论:本研究成功地克隆了luf-fin-a一个新的序列,并建立了该蛋白的原核表达系统,同时利用亲和层析可一步法纯化获得目的蛋白。

摘要：目的　了解SEN病毒D亚型中国株的流行病学特点及其进化地位。方法　分析已知的基因序列设计引物 ,建立半套式PCR检测方法 ,对 5 8份献血者血清样本和 2 5份non A～E肝炎患者血清样本进行了SENV D亚型的检测 ,并对部分阳性血清的PCR产物进行克隆测序。结果　无偿献血者中SENV D亚型感染率为 4 5 % ,在non A～E肝炎患者中SENV D亚型感染率为 4 8% ,两者间差异无显著性 ;但在无偿献血者中SENV D亚型的阳性检出率大大高于国外报道。测序结果经BLASTP软件在GenBank中检索表明 ,各测序株均与已知的SENV D株序列有很高的同源性 ,并在此基础上用MegAlign软件进行进化树分析。结论　建立的半套式PCR检测方法适用于SEN病毒D亚型检测 ;SENV D亚型中国株之间以及与已发表的国外SENV D株序列之间有变异。与无偿献血者相比 ,non A～E肝炎患者血清SENV D株无进化上的显著倾向性。在测序的部分ORF1序列中存在一个核苷酸高变区。

摘要：目的 :将编码血红蛋白α99,β82 位Lys的密码子突变为编码Cys的密码子。方法 :将待突变的目的基因克隆到 pALTER Ex2载体上 ,采用寡核苷酸介导的定点突变进行突变。 结果 :初步筛选得到的克隆经序列测定表明 ,达到预期设计的目的 ,未发生意外突变。结论

摘要：目的：观察 HBV-三磷酸（3p）-小干扰 RNA（siRNA）激活受试小鼠Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应以及抑制 HBV 基因组复制的双重作用。方法针对 HBV 基因组 S/P mRNA 设计并通过体外转录法制备带有5′-3p-修饰的 HBV-3p-siRNA；以未经修饰的 HBV-siRNA 和阴性对照（NC）-siRNA 作为对照；利用尾静脉水动力注射法建立 HBV 感染小鼠模型。将40只小鼠分为4组，每组10只，模型组：仅注射 pGL3．0-HBV 1．2拷贝质粒；阴性对照组：腹腔注射 NC-siRNA；HBV-siRNA 组：腹腔注射 HBV-siRNA；HBV-3p-siRNA 组：腹腔注射 HBV-3p-siRNA。ELISA 法检测小鼠血清中HBsAg 的表达和β干扰素的分泌量；荧光定量 PCR 检测小鼠血清 HBV DNA。采用 LSD 或 Dunnett T3统计方法进行 One way-ANOVA 统计学分析。结果小鼠血清中β干扰素水平模型组为（12．37±5．32）pg/mL，阴性对照组为（22．61±6．29）pg/mL，HBV-siRNA 组为（26．40±5．39）pg/mL，HBV-3p-siRNA 组为（68．37±21．00）pg/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异有统计学意义（F 值分别为23．988、46．523，均 P ＜0．01）。小鼠血清中 HBsAg 水平模型组为（2864．86±907．11）ng/mL，阴性对照组为（2198．86±456．89）ng/mL，HBV-siRNA 组为（1049．71±396．28）ng/mL， HBV-3p-siRNA 组为（640．86±383．08）ng/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异有统计学意义（F 值分别为23．537、39．144，P 值分别为0．025、0．010）。小鼠血清中 HBV DNA 的水平模型组为（2．54×104^±1．46×10^4）拷贝/mL，阴性对照组为（2．22×10^4±2．62×10^3）拷贝/mL， HBV-siRNA组为（3．59×10^3±2．88×10^3）拷贝/mL，HBV-3p-siRNA 组为（2．65×10^3±1.46×10^3）拷贝/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异均有统计学意义（F 值分别为15．013、16．741，均 P ＜0．05）。HBV-3p-siRNA、HBV-siRNA，以及 NC-siRNA 对 HBV 感染小鼠的体质量无明显影响。结论HBV-3p-siRNA可以通过 RNA 干扰机制特异性抑制 HBV 复制，提高机体天然免疫功能，是一种新型抗HBV核酸分子。

摘要：目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。

摘要：猪内源性反转录病毒(PERV)是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。

摘要：近年来,树突状细胞(dendritic cells, DC)作为抗原提呈能力最强的、也是惟一能激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),已成为肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一.

摘要：目的:探讨用长链核酸扩增技术评价病毒灭活效果的可行性。方法:针对伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用半巢式PCR技术扩增经低pH法(4.0±0.1)、巴氏消毒法(60±1.0)℃和S/D法(有机溶剂/洗涤剂)处理后的PRV核酸,同时以细胞感染法做平行对照。结果:低pH对PRV核酸有破坏作用,处理时间越长,核酸损伤程度越明显,处理60min时,6.62lgTCID50的PRV完全被灭活。5条不同长度PCR扩增产物中,只有3.9kb的长片段检出与细胞培养结果一致。7.25lgTCID50的PRV经(60±1.0)℃处理20min后即被完全灭活,7.13lgTCID50的PRV经S/D法处理1h后被完全灭活,但各长度核酸片段扩增均为阳性,与细胞感染试验结果不符。结论:低pH对PRV核酸的损伤程度随处理时间的延长而增加;用长链PCR(3.9kb)技术来评价经低pH法灭活病毒的效果是可行的,而该法不适合评价巴氏消毒法和S/D法灭活病毒的效果。

摘要：药物开发的不同阶段,人们通过系列的体外试验研究、动物实验以及随后人体应用的结果试图揭示药物的毒副作用,目的是为确保人体用药的安全性。其中代谢转化诱导的毒性占据药物毒性的很大一方面,尤其反应性代谢产物引发的毒性近几年越来越引起重视。本文综述了几类代表性化合物结构产生反应性代谢产物的情况,包括苯醌亚胺、噻吩环、氮翁离子、环氧化物、硫脲等,试图从代谢角度揭示药物分子结构与药物毒性之间的关系,为药物的设计与开发提供参考。