摘要：蛋白质内部多个位点的翻译后修饰在基因的功能调节过程中发挥重要作用,基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,因此,高效、快速构建基因的多个点突变体在基因的功能研究中意义重大.本研究在建立了对目的基因进行高效准确的单点突变方法的基础上,以SRrp53点突变体的构建为例,设计了新型的以反向PCR为基础的多个点突变的实验流程,获得的多位点突变体质粒经测序后均与预期相符,将测序正确的多位点突变体质粒转染293T细胞后,均表达了分子质量正确的蛋白质.以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因多个点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础.

摘要：目的:设计并构建ErbB2的小干扰RNA,检测其对ErbB2蛋白表达的干扰效果,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:设计2条针对ErbB2的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上。经酶切和测序证明构建成功后,将其与pcDNA3-FLAG-ErbB2共转染于293T细胞,以及单转siRNA于乳腺癌SKBR3和ZR75-1细胞,通过Western blot分别检测siRNA对外源和内源ErbB2的干扰效果。通过结晶紫实验研究siRNA对ZR75-1生长的影响。结果:Western blot证明构建的两条ErbB2 siRNA均能有效抑制外源和内源ErbB2蛋白的表达,并抑制乳腺癌ZR75-1细胞的生长。结论:构建的siRNA能有效地抑制ErbB2蛋白的表达并抑制ZR75-1细胞的生长。

摘要：目的:构建FHL2基因的siRNA真核表达载体,观察其对FHL2蛋白表达的影响。方法:利用RNAi干扰技术,设计并合成了两条针对FHL2基因的siRNA,将其克隆到siR-NA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上。将重组质粒和带FLAG标签的FHL2共转染293T人胚肾细胞,通过Western blot实验检验RNAi干扰效应。结果:经过酶切和测序证明,成功构建了FHL2 siRNA真核表达载体。通过Western blot证明,构建的siRNA能有效抑制FHL2基因的表达。结论:成功地构建了FHL2基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制FHL2基因的表达。

摘要：在原核表达中影响外源基因表达效率的因素有很多,这其中翻译起始效率起了非常重要的作用。翻译起始效率又主要受SD序列、SD序列与起始密码子之间的间距、DB(DownstreamBox)序列、mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构和稀有密码子等因素的影响。主要针对DB序列和5′端稀有密码子的优化设计了软件。通过计算机对序列进行分析比对后,按照匹配碱基数、匹配位置、密码子使用频率平均值的顺序进行排序,给出一些优化序列,并给出了软件算法。

摘要：为了探讨人造血相关的PBX相互作用蛋白质基因(HPIP)在肿瘤发生发展中的生物学作用,构建了HPIP小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,验证其敲减效果并观察其对细胞生长增殖的影响.根据人HPIP的cDNA序列,设计了含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测HPIP基因的表达水平;结晶紫实验及流式细胞技术检测敲减HPIP基因表达对细胞生长和增殖的影响,软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响.结果显示,构建的siRNA能够有效抑制HPIP基因的表达;结晶紫实验与细胞周期分析实验显示,siRNA介导的HPIP表达沉默导致细胞生长增殖的显著抑制,软琼脂实验结果表明,稳定转染HPIP siRNA能够抑制肿瘤细胞的锚定非依赖性生长.上述结果初步表明,HPIP siRNA能明显抑制肿瘤细胞的生长与增殖,可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.

摘要：艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因,构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α(pABK-HIV-MF)和pABK-CKR5-CD4(pABK-HIV-MT),在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达,这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞(DC)清除研究奠定了基础。

摘要：合成生物学研究是个新兴而颇具前景的研究领域。该研究对多种天然的或人工设计的生物学元件进行了合理而系统的组合以获得重构的或非天然的“生物系统”。从解构到重构生命体、由破到立的认识方式转变,是对生物系统认识深入发展的必然结果。合成生物学研究就是连接这一过程的桥梁。本文对这一前沿领域的研究思路、近期主要研究成果及发展趋势做一概述。

摘要：基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,如何高效、经济地构建基因点突变体是许多分子生物学研究遇到的棘手问题.以PIAS3点突变体的构建为对象,设计了新型的以反向PCR为基础的点突变构建流程,获得的点突变体质粒经测序后均与预期相符,并在293T细胞内得到了正确表达.以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础.

摘要：目的:原核表达、纯化肿瘤-睾丸抗原CT45-5基因,并制备多克隆抗体,以研究其在Fhit特异的信号通路中的作用。方法:设计出特异针对CT45-5的引物,通过RT-PCR扩增出CT45-5的编码基因,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达和纯化了CT45-5,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的CT45-5蛋白。结论:肿瘤-睾丸抗原CT45-5能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究CT45-5的功能奠定了基础。

摘要：目的 :克隆牛m1和m5受体亚型特异性区域内环 (innerloop) 3区 ,并检测牛主动脉内皮细胞上两种受体mRNA的表达。方法 :根据人、小鼠的m1和m5受体序列 ,设计并合成针对两种受体内环 3区的特异性引物。采用RT_PCR法从牛海马组织中扩增牛m1和m5受体内环 3区 ,并通过半定量RT_PCR法检测两种受体mRNA在传代培养前后的牛主动脉内皮细胞中的表达。结果 :序列测定与对比表明克隆得到了牛m1和m5受体内环 3区。半定量RT_PCR结果显示 ,原代牛主动脉内皮细胞表达m1受体mRNA而未检测到m5受体mRNA ,两种受体mRNA在传 10代的培养牛主动脉内皮细胞中均未检测到有表达。结论