摘要：目的建立Ronin基因造血系统条件性敲除的小鼠模型。方法基于Lox P-Cre系统设计基因敲除策略,获得Roninflox/+(flanked by lox P)小鼠,分别与Vav-iCre+小鼠、Roninflox/+小鼠交配繁殖得到Roninflox/+Vav-iCre+小鼠和Roninflox/flox小鼠,再将后两种小鼠交配获得Roninflox/floxVav-iCre+小鼠。提取鼠尾组织DNA,PCR扩增后鉴定基因型,提取小鼠造血相关组织蛋白,Western印迹检测Ronin表达情况。结果 Roninflox/+Vav-iCre+小鼠与Roninflox/flox小鼠交配所得子代共51只小鼠中,Roninflox/floxVav-iCre+基因型小鼠仅1只,实际出生数量远低于理论值,且小鼠出生1周内死亡。Roninflox/+Vav-iCre+基因型小鼠可正常存活,其造血相关组织中Ronin表达低于野生型小鼠。结论该研究构建了造血系统特异缺失Ronin基因的小鼠,为研究Ronin在早期造血调控中发挥的作用提供了动物模型。

摘要：目的：应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法：针对YOD1基因设计单链向导RNA（sg RNA）识别序列,构建sg RNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型（WT）和敲除（KO）小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹（WB）技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子（HET）自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验（GTT）分析KO小鼠的血糖调控能力。结果：基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论：应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。

摘要：目的验证受试品(抗人CD20嵌合单克隆抗体,biosimilar,B)与参比品(利妥昔单抗,rituximab,美罗华,reference,R)在方法学上的类似性。方法受试品和参比品的测定采用双抗夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA),检测结果用Watson LIMSTM V.7.3.0.01(Thermo Scientific公司)软件进行处理,方法类似性比较采用均衡实验设计并用Allfit软件中平方和的统计方式比较标准曲线类似性,方法从准确度、精密度、特异性、灵敏度、选择性、稀释线性及稳定性等方面进行系统验证。结果受试品与参比品标准曲线平衡实验结果进行类似性比较,统计结果P=0.0507无统计学差异(P>0.05);系统性验证结果表明,受试品和参比品批内准确度和精密度分别在5.6%~7.7%,-9.0%^-0.8%内,受试品和参比品批间准确度和精密度分别在6.5%~7.2%,-7.3%^-3.2%内,受试品和参比品的总误差≤13.9%,满足方法学接受标准;选择性、特异性、稀释线性和稳定性在方法学接受范围内。结论经平衡实验设计和系统验证的ELISA法,满足生物类似物方法学接受标准,可用于利妥昔单抗生物类似药药动学研究。

摘要：目的建立并验证自主开发的酶联免疫吸附分析法(ELISA),检测食蟹猴血清中重组抗核因子κB受体活化因子配体(RANKL)人源化单克隆抗体(受试品,T)的浓度,以研究受试品在食蟹猴体内的药动学(PK)特征,为受试品潜在的生物类似药药效和毒理研究,以及临床给药方案的设计和优化提供依据。方法选取健康食蟹猴32只,分为4组,分别为0.5、3、18 mg·kg^(-1)皮下注射给药组和3 mg·kg^(-1)静脉注射给药组,对采集样品中的受试品浓度采用验证的ELISA进行检测,检测的血药浓度导入WinNonLin^(■)v6.4(Pharsight公司)对药动学参数进行计算。结果自主建立的ELISA法定量范围为31.3~2000 ng·mL^(-1),批内、批间精密度和准确度在3.3%~11.6%和-14.4%~14.8%内,该方法符合法规要求的准确度、精密度、特异性、灵敏度、稀释线性、钩状效应、选择性、平行性和稳定性。食蟹猴皮下注射0.5、3、18 mg·kg^(-1)和静脉注射3 mg·kg^(-1)受试品后,分别于24~72、10~72、24~168和0.0833~4 h达峰;达峰浓度(ρ_(max))分别为(7.57±0.872)、(37.9±6.72)、(250±35.5)和(87.2±13.8)μg·mL^(-1);暴露水平(AUC0-t)分别为(1630±496)、(8810±3800)、(94700±34900)和(12000±4370)μg·h·mL^(-1);皮下注射3 mg·kg^(-1)受试品的绝对生物利用度为73.4%。结论自主建立的ELISA法,可用于支持受试品的药动学研究;药动学研究结果表明,食蟹猴皮下注射0.5~18 mg·kg^(-1)受试品后,在给药剂量范围内呈线性药动学特征。

摘要：植物凝集素是广泛使用的糖蛋白富集和识别材料,动物凝集素则较少被尝试用于糖蛋白富集。基于人源半乳糖凝集素-3的糖识别结构域(CRD),设计了两种重组凝集素:Gal3C(一个CRD)和Tetra-Gal3C(四重串联CRD)。通过将两种凝集素固定于链霉亲和素琼脂糖小球上,构造了富集糖蛋白的重组凝集素亲和柱。使用凝胶电泳、免疫印迹以及生物质谱技术对重组凝集素的生物特征及其糖蛋白富集能力进行了表征与评价,发现两种类型的重组凝集素对糖蛋白/糖肽都有良好的富集效果,并具有较高的特异性和灵敏度。相对于Gal3C而言,TetraGal3C由于具有四重串联的CRD结构域,表现出更高的糖蛋白/糖肽富集能力。该凝集素亲和柱成功用于人肝癌细胞系HepG2的糖蛋白富集,表明重组凝集素具有从复杂生物样本中选择性识别和富集糖蛋白/糖肽的能力。

摘要：CXC趋化因子受体2(the CXC chemokine receptor 2,CXCR2)介导的中性粒细胞趋化在细菌感染、慢性炎症、肿瘤发生发展过程中发挥着至关重要的作用,但是目前对于CXCR2受体及下游信号的调控并未被完全揭示。该研究首先以Flag-CXCR2-Tango质粒为模板设计Flag-CXCR2的特异性引物,PCR扩增后将其连接至pCDH-MCS-T2A-Neo-MSCV慢病毒表达载体上,随后对阳性克隆进行测序及表达验证。接着在HEK-293T细胞中包装过表达Flag-CXCR2的慢病毒颗粒并感染HEK-293细胞,使用遗传霉素筛选后,蛋白质免疫印迹和免疫荧光检测发现,Flag-CXCR2稳定表达在HEK-293细胞膜上。最后利用白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)刺激过表达Flag-CXCR2的细胞株,检测发现CXCR2下游信号通路活化及F-actin组装。

摘要：肿瘤的特异性基因突变是肿瘤免疫疗法的理想靶标,突变的基因在健康组织中缺乏表达,而且具有高度免疫原性,容易被免疫系统识别。肿瘤患者突变基因组的高度特异性使得个体化免疫治疗存在极大挑战,而每一种肿瘤都具有区别于其他肿瘤的代表性的基因突变特征,基于这些突变特征,有可能开发出特定肿瘤适用的免疫治疗策略。文中提出一个兼顾抗原胞内呈递和与胞外MHC分子结合能力的肿瘤新抗原预测策略,整体设计更为合理;相对于常规方法,能够大幅缩小实验验证的范围。基于该策略,利用TCGA数据库中多种肿瘤的基因突变数据进行肿瘤新抗原预测并预测到大量潜在的肿瘤新抗原。肿瘤新抗原的预测结果显示出肿瘤类型的特异性,并且在特定肿瘤数据集中能够覆盖20%–70%不等比例的肿瘤患者。文中提出的肿瘤新抗原预测方案在未来的肿瘤临床治疗上具有潜在的应用价值。

摘要：受体占位(RO)是评价药物与受体结合的重要研究内容,可用于药效学和安全性评估,在药物研发的各个阶段均发挥重要作用,但该研究也面临许多技术和操作可行性方面的挑战。建立一个准确的可重复的RO方法需考虑诸多因素,如:选择合适的检测模式(直接法或间接法)、检测试剂、样品类型和目标细胞群等,还要充分考虑受体表达、受体调节以及样本稳定性等其他因素对实验结果的影响。本文对基于流式细胞术受体占位实验设计的几个关键考虑要点进行了系统全面地讨论。

摘要：蛋白质磷酸化是广受关注的翻译后修饰类型之一,组氨酸磷酸化作为一种非常见的磷酸化修饰,最早被发现在细菌和低等真核生物信号传导的级联反应中起关键作用。近年来研究显示,其在肿瘤发生发展过程中也可能扮演了重要角色。由于磷酸化组氨酸的化学不稳定性、低丰度、亚化学计量性质、缺乏特异性的富集试剂,导致研究手段缺乏,限制了人们对磷酸化组氨酸修饰底物蛋白质的认识。随着磷酸化组氨酸抗体的设计以及富集和质谱等鉴定方法的发展,更多的磷酸化组氨酸修饰底物被鉴定,从而加速了对磷酸化组氨酸生物学功能的认识。本文介绍了磷酸化组氨酸的化学性质、主要生物学功能,并综述了磷酸化修饰底物富集和鉴定技术等方面的最新进展,同时也要看到组氨酸磷酸化修饰组学研究仍然存在巨大的技术挑战。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术,构建靶向精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)的基因编辑质粒,建立prmt3基因稳定敲除的A549细胞株,检验prmt3基因敲除效率及其对A549细胞增殖的影响。方法设计靶向prmt3基因的sgRNA序列,将合成的片段克隆到CRISPR/Cas9质粒载体Lenti CRISPR中,挑取单克隆进行测序验证。将构建好的重组质粒和空载体分别进行慢病毒包装,并感染A549细胞,利用嘌罗霉素进行筛选获得PRMT3稳定敲除细胞株,Western印迹检测细胞中PRMT3蛋白的敲除效率。将敲除PRMT3的A549细胞进行单克隆分选,分别利用平板克隆形成实验检测PRMT3敲除后细胞增殖能力,平板划痕实验检测其迁移能力,流式细胞技术检测细胞周期的变化,质谱进行蛋白质组学分析,初步筛查PRMT3可能的底物。结果经测序验证,成功构建了靶向prmt3基因的Lenti CRISPR-PRMT3-sgRNA质粒。经Western印迹检测,A549 PRMT3敲除株中PRMT3的蛋白表达水平明显降低。经单克隆分选,成功获得PRMT3完全敲除的A549细胞株。PRMT3敲除导致A549细胞的克隆形成能力明显增强,细胞迁移能力不变,细胞周期发生G2/M期阻滞。进一步用蛋白质组学的方法初步鉴定了PRMT3可能的底物。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PRMT3稳定敲除的A549细胞株,发现PRMT3能调控细胞周期和增殖,并对其分子机制做了初步探索。