摘要：目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RBD融合,电转化至毕赤酵母中;通过细胞免疫荧光分析,筛选能够成功展示RBD的锚定系统;进一步分析其与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力,证明展示在细胞表面RBD分子的功能。结果:仅Sed1p锚定分子能够有效呈递RBD至毕赤酵母细胞表面,展示效率约为70%;亲和力分析结果表明,ACE2受体和表面展示RBD的亲和力(K_(D)=30.42 nmol/L)与溶液中RBD的亲和力(K=16.00 nmol/L)较为接近。结论:这一体系能够在毕赤酵母表面高效地展示具有生物学功能的RBD,可用于抗新冠病毒RBD药物的高通量筛选和评价。

摘要：背景肝癌的发病率和死亡率逐年攀升,对肝癌发生发展机制的研究尤为重要。目的应用CRISPR/Cas9技术在人肝癌HepG2细胞中敲除组蛋白去乙酰酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)基因,构建HDAC6基因敲除的HepG2稳定表达细胞系,并检测其对人肝癌细胞生长的影响。方法根据CRISPR/Cas9技术靶点设计原则设计特异性识别HDAC6基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)序列,构建LentiCRISPR-HDAC6-sgRNA真核重组表达质粒,测序鉴定后包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选得到敲除HDAC6基因稳定表达的细胞系,Western blot鉴定HDAC6基因的敲除效果,CCK-8生长曲线实验检测HDAC6基因敲除对细胞增殖能力的影响,划痕实验和Transwell迁移实验检测HDAC6基因敲除对细胞迁移能力的影响。Western blot鉴定HDAC6基因敲除对调节α-tubulin乙酰化的影响,细胞存活曲线实验检测HDAC6基因敲除后HepG2对HDAC6抑制剂ACY-1215的敏感度,采用流式细胞术检测HDAC6基因敲除对HepG2细胞周期分布和凋亡的影响。结果成功构建HDAC6基因敲除的HepG2稳定表达细胞系后,经实验证明HDAC6基因敲除能够显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移,使α-tubulin的乙酰化表达增强且能降低HepG2对ACY-1215的敏感度,还能使HepG2细胞发生G1期阻滞,促进HepG2细胞的凋亡。结论敲除HDAC6基因可以抑制HepG2细胞增殖和迁移,使α-tubulin乙酰化程度增加,调节HepG2细胞对ACY-1215的敏感度,且影响HepG2细胞的周期和凋亡,为进一步研究HDAC6在肝癌中的功能机制奠定了基础。

摘要：目的:用真核细胞表达可溶性尼帕病毒融合蛋白(sF),通过免疫小鼠获得抗F蛋白的特异性血清。方法:设计构建重组质粒pcDNA-sF,在哺乳动物表达系统中进行表达,通过Strep柱亲和层析纯化目的蛋白,Western印迹检测目的蛋白,免疫小鼠后制备抗F蛋白的特异性血清,并通过ELISA鉴定抗血清的结合活性。结果:尼帕病毒F蛋白在哺乳动物细胞中获得可溶性表达,纯化得到的目的蛋白大小正确,胰蛋白酶切鉴定其具有与天然蛋白相似的切割产物;制备的抗血清能特异性结合目的蛋白。结论:获得了可溶性尼帕病毒融合蛋白及高效价抗F蛋白的特异性血清,可用于尼帕病毒疫苗评价、特异性抗体筛选等相关研究。

摘要：目的探讨细丝蛋白A(FLNA)对前列腺癌细胞迁移的影响。方法设计并构建靶向FLNA的shRNA敲低质粒pSIH⁃H1⁃shFLNA。包装慢病毒后感染前列腺癌C4⁃2细胞,获得敲低FLNA的稳定细胞系C4⁃2⁃shFLNA。Western印迹检测前列腺癌C4⁃2细胞中FLNA蛋白表达和PC⁃1蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测FLNA以及PC⁃1 mRNA表达水平;Western印迹检测敲低FLNA对磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响;划痕实验和Transwell实验检测C4⁃2细胞体外迁移能力。结果前列腺癌C4⁃2细胞敲低FLNA后FLNA mRNA和蛋白水平明显下调,PC⁃1 mRNA水平和蛋白水平表达增加,同时AKT磷酸化水平显著升高。划痕及Tran⁃swell实验证实在前列腺癌C4⁃2细胞中敲低FLNA后细胞迁移能力增强。结论前列腺癌细胞中敲低FLNA能够激活PI3K/AKT信号通路,促进前列腺癌细胞迁移。

摘要：目的:用大肠杆菌表达可溶性A型肉毒毒素(BoNT/A)重链。方法:按大肠杆菌偏好密码子设计合成重链N端(HN)编码序列,重叠延伸PCR连接HN和重链C端(HC)构成重链基因;将重链基因构建至pTIG-TrxA载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),厌氧培养与好氧培养分别诱导表达重链;SDS-PAGE比较表达条带,ELISA比较不同表达条件的重链表达水平。结果:测序结果表明正确设计合成了HN编码序列;SDS-PAGE结果显示重链厌氧表达条带的相对分子质量与预期一致,好氧表达条带的相对分子质量比预期小;定性ELISA结果显示静置培养表达的重链活性远远高于摇床培养。结论:BoNT/A重链在大肠杆菌中厌氧条件下表达活性明显高于好氧表达,为厌氧生物蛋白在大肠杆菌中的表达提供了新思路。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现EGFP基因在CHO细胞ACTB基因座位置定点整合和表达,建立基于CRISPR/Cas9技术的外源基因定点整合和表达技术。方法:根据CHO细胞β-actin(ACTB)基因起始密码子区基因序列,设计相应CRISPR/Cas9系统,同时构建含有ACTB同源臂和EGFP基因的同源供体载体(donor vector),通过脂质体转染法同时转染CRISPR/Cas9和供体载体,流式分选EGFP阳性细胞,分析基因编辑技术在EGFP基因定点整合和表达方面的可行性。结果:构建了能有效切割CHO细胞ACTB基因的CRISPR/Cas9系统,筛选到EGFP定点整合至ACTB基因座并有效表达的细胞,ACTB基因缺失后由于γ-actin代偿性表达增强,ACTB缺失细胞形态和生长未受影响。结论:单纯依靠基因编辑技术可以实现1 kb以内的基因同源置换,但效率较低,如实现更大片段的外源基因置换,需借助其它实验技术。

摘要：目的 基于分步偶联策略,借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子黏合方法(SpyTag/SpyCatcher系统),建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法 设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的SpyTag短肽,将二者于20℃振荡孵育以获得中间产物SpyTag-CpG。将SpyCatcher与蛋白抗原Omp19融合表达,通过亲和层析及凝胶过滤层析获得SpyCatcher-Omp19重组蛋白。通过本实验室构建的志贺菌多糖抗原SpyCatcher-OPS糖蛋白表达系统,获得SpyCatcher-OPS糖蛋白。将SpyTag-CpG分别与SpyCatcher-Omp19重组蛋白和SpyCatcher-OPS糖蛋白连接,获得CpG佐剂与抗原共价偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,经SDS-PAGE分离后,通过荧光分析验证终产物结构。结果 马来酰亚胺和FAM同时标记的CpG-1018和SpyTag连接后,SDS-PAGE检测结果可见对应于SpyTag-CpG交联产物的高相对分子质量条带。马来酰亚胺修饰的CpG-1018与SpyTag连接后,质谱分析结果显示,SpyTag-CpG的相对分子质量与其理论相对分子质量相符合。将中间产物SpyTag-CpG与蛋白抗原SpyCatcher-Omp19、多糖抗原SpyCatcher-OPS孵育连接后,考马斯亮蓝染色和FAM荧光检测均可见对应于终产物CpG-Omp19和CpG-OPS的高相对分子质量条带。结论 成功建立基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术,获得了CpG佐剂与两种不同类型抗原的偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,为未来开发质量可控的自佐剂疫苗奠定了基础。

摘要：基因编辑技术是一种对生物体目标基因进行定点“编辑”的工程技术,近年来发展非常迅速,已冲击到生命科学的各个领域,是世界范围内竞争最为激烈的下一代核心颠覆性生物技术。基因编辑技术已应用于农作物改良、畜牧业育种、遗传与代谢性疾病的治疗、抗细菌和病毒感染、药物筛选、制备新型生物燃料等领域。其在军事医学领域也有重要用途:通过基因编辑技术,使病原体危害性增大、毒性增强;靶向病原体的保守序列设计药物、疫苗等,可以防御多个毒株和变异体的感染;靶向宿主,CRISPR/dCas9系统介导的表观遗传基因编辑,不改变DNA遗传性状,也能可逆性增强人体效能,抵抗生物、化学、放射损伤;靶向基因编辑器自身的核酸酶和引导RNA,能精准调控基因编辑技术,防御基因编辑技术谬用和新型基因类生物战剂造成的危害。基因编辑技术在传染病诊治领域也具有显著优势,能彻底治愈某些类型的传染病。

摘要：目的:建立一套简便、对RNA样本起始量要求很低的RNA测序建库方法,在此基础上引入分子条形码技术,从而使RNA-seq的数据所反映的表达丰度更加客观真实。方法:将微量RNA用RNaseⅢ片段化后,利用反转录酶的反转录活性、模板转换活性以及DNA依赖的DNA聚合酶活性,一步实现从RNA到cDNA文库的反应,再通过PCR扩增获得适合测序仪的测序文库,通过测序分析验证建库效果,最后采用荧光定量PCR法测定部分基因的表达量以验证测序结果,同时比较分子条形码的引入对表达量分析的影响。结果:通过电泳观察和测序结果分析,选择Clontech公司的SMARTscribe,反转录和模板转换反应温度设为50℃,反转录完成后经AMPure Beads纯化再经PCR扩增得到测序文库,电泳检测文库DNA长度和浓度符合测序要求。比较发现,用分子条形码建库的测序结果能够更加真实地反应基因的实际表达量。结论:初步建立了针对10 ng RNA样品的RNA-seq建库技术,并在建库方案中加入分子条形码使其测序结果更加真实地反映基因表达量。该技术未来可适用于微量RNA样品的高通量测序。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肝癌细胞HepG2中的四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)基因,构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别FHL1基因第三外显子相关序列的上下游小向导RNA,构建真核重组表达质粒,测序鉴定后,将重组质粒包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素抗性筛选稳定敲除FHL1基因的细胞株,用免疫印迹法鉴定HepG2细胞中FHL1基因的敲除效果,利用生长曲线实验和划痕实验检测基因敲除对细胞生长和迁移的影响。结果:筛选出敲除FHL1基因的HepG2细胞株,且FHL1基因敲除显著促进细胞的增殖和迁移。结论:利用CRISPR/Cas9技术获得了内源FHL1基因敲除细胞株,初步实验提示敲除FHL1基因可以促进肝癌细胞增殖和迁移,为后续研究FHL1在肝癌中的功能奠定了基础。