摘要：本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体,以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEND)炎性反应中的作用。使用1μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型,qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化;设计2对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列和1对无义序列,退火后分别连接至pCD513B-U6载体构建3个重组质粒,随后进行酶切和测序鉴定。将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒,获得病毒颗粒后用其感染BEND,2μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率。LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞,采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1βmRNA的表达变化。结果表明:LPS处理BEND后,IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高,表明BEND炎性反应模型构建成功。同时,LPS处理后,生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高,提示其可能参与BEND炎性反应的调控;成功构建2个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1和sh2,WB结果显示,sh1和sh2均能有效降低NR1D1的表达,其中sh2的干扰效果最好,使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2的敲低细胞系;LPS处理后,炎症因子在sh2细胞系中的表达显著高于shn组。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体,通过转染BEND细胞,筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系,发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用,为后续深入探究NR1D1在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础。

摘要：为揭示地方水稻品种中稻瘟病持久抗性基因Bsr-d1序列变异类型,本研究以收集到的缅甸、老挝和越南共79份地方水稻品种为供试材料,设计抗稻瘟病Bsr-d1基因特异引物对Bsr-d1基因启动子功能位点区段进行PCR扩增及测序分析。研究表明,79份地方水稻均持有抗稻瘟病Bsr-d1或bsr-d1等位基因,品种间存在18个变异位点和22个碱基的差异,根据差异所有品种可归为6种单倍型,其中H4和H6为优势单倍型,分别占测试品种的20.25%、58.23%;6种单倍型中仅H3单倍型携带抗性位点,有8个材料归为此类型,占10.13%。缅甸地方品种拥有H1(15.79%)、H2(2.63%)、H3(13.16%)、H4(18.42%)、H6(50%)等5种单倍型,优势单倍型为H6;老挝地方品种有H1(2.56%)、H3(7.69%)、H4(23.08%)、H5(2.56%)、H6(64.10%)5种单倍型,H6为优势单倍型,表明缅甸、老挝间在单倍型种类和抗性品种比例上均存在一定差异。本研究结果表明缅甸、老挝水稻资源携带持久抗性基因Bsr-d1的品种比例远高于中国品种,对中国选育稻瘟病持久抗性品种具有重要的利用价值,应加强对该地区种质的引进和分析评价。

摘要：乙醇梭菌蛋白(Clostridium autoethanogenum protein,CAP)是一种新型细菌蛋白,尚未见其对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉品质影响的相关研究。本实验旨在揭示乙醇梭菌蛋白作为草鱼饲料中单一蛋白源时对肌肉品质所产生的影响。设计了6组不同乙醇梭菌蛋白含量饲料(蛋白质含量为24.45%、27.31%、31.82%、35.79%、38.64%和42.82%,分别命名为CAP1、CAP2、CAP3、CAP4、CAP5和CAP6),以初始体重(4.56±0.01) g的草鱼幼鱼进行56 d的养殖实验。结果如下:(1)CAP4组草鱼空壳率、肌肉pH显著提升,而肌肉蒸煮损失随蛋白质水平上升线性增加(P<0.05);(2)肌肉硬度、弹性、凝聚力、黏性、咀嚼力和回复力均随饲料蛋白质水平升高呈现先升高后降低的二次模型趋势(P<0.05),根据硬度估计最佳蛋白质水平为33.53%;(3)肌肉组织学显示CAP4组肌肉密度显著升高(P<0.05);(4)肌肉过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)随着饲料蛋白质水平的增加而显著降低,丙二醛(MDA)含量先下降后上升(P<0.05);(5)肌肉中myod、myog、myf5、mstn、fgf6a、fgf6b、myhc-2、myhc-4、tor、s6k1、nrf2、keap1a、ck2α、igf-I和igf1r的相对表达呈现二次模型变化(P<0.05), CAP4组中igf-II的相对表达水平显著高于CAP2组(P<0.05), myhc-7和myhc-1基因表达随饲料蛋白质水平呈线性上升趋势(P<0.05)。本研究表明,以乙醇梭菌作为蛋白源,适宜饲料蛋白质水平(33.53%)可改善草鱼肌肉品质。

摘要：本研究旨在利用单碱基编辑系统(single base editing system)实现欧拉藏绵羊成纤维细胞FecB和GDF9基因靶位点A到G和C到T的碱基替换并检测其编辑效率。首先设计合成靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA序列,再分别连接至epi-ABEmax、epi-BE4max质粒,构建载体并电转至欧拉藏绵羊成纤维细胞,最后对阳性细胞FecB和GDF9基因进行Sanger测序鉴定靶位点突变结果,并通过T-A克隆估算单碱基编辑系统的编辑效率。结果显示获得了靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA,并构建使欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因单碱基突变的载体,FecB基因靶位点编辑效率为39.13%,GDF9基因靶位点(G260、G721、G1184)编辑效率分别为10.52%、26.67%和8.00%。本研究运用单碱基编辑系统在欧拉藏绵羊成纤维细胞上实现了FecB和GDF9基因靶位点突变,为改良欧拉藏绵羊一胎多羔的繁殖性状奠定理论基础。

摘要：白叶枯病和条斑病是水稻重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoc)属于同种下的2个致病变种。鉴别Xoo和Xoc对检疫和防控这2种病害至关重要。Xoo和Xoc中的铁-红酵母酸/铁-粪生素受体基因fhuE在进化过程中因不同程度地缺失而成为假基因。针对Xoc中有而Xoo中缺失的fhuE部分序列设计引物,筛选出Xoc特异引物XocFhuE-F(5’-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3’)和XocFhuE-R(5’-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3’)。用XocFhuE-F/XocFhuE-R能只从Xoc菌株中仅扩增出159 bp片段,并结合荧光染料建立了SYBR Green实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和EvaGreen微滴数字PCR(digital PCR,dPCR)方法来检测鉴定Xoc。在20μL反应体系中加1μL模板,qPCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×10^(4)CFU/mL,检测带菌种子中Xoc的下限是1.2×10^(3)CFU/粒;d PCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×10^(3)CFU/mL,检测带菌种子中Xoc的下限是1.2×10^(2)CFU/粒。综上所述,基于Xoc特异引物XocFhuE-F/XocFhuE-R建立的SYBR Green qPCR和EvaGreen dPCR为检疫Xoc和监测预警水稻条斑病提供了高效的检测方法。

摘要：本试验旨在探究不同磷源对泌乳后期奶牛泌乳性能和血浆代谢物的影响。选择60头体重、胎次、采食量和泌乳天数相近的泌乳后期荷斯坦奶牛,采用单因素试验设计随机分为2组,每组30头。2组奶牛饲粮中的磷分别来源于磷酸氢钙(DCP)和采用高温烧结法制备的磷酸三钙(TCP),2种饲粮主要营养成分和钙、磷含量均一致。试验期65 d,包括预试期10 d和正试期55 d,期间每天记录试验牛的产奶量,并于试验第30和65天采集乳样并进行奶牛生产性能测定(DHI),第65天采集血液测定血浆中的代谢物。结果表明:1)2组奶牛产奶量和乳成分之间均无显著差异(P>0.05);2)2组奶牛血浆碱性磷酸酶活性以及降钙素、甲状旁腺素和钙含量之间均无显著差异(P>0.05),DCP组血浆磷含量显著高于TCP组(P<0.05);3)不同磷源条件下奶牛血浆中存在的差异代谢物有31种,其中TCP组血浆代谢物相对DCP组上调的有肌肽、甲基咪唑乙酸等,通过对差异代谢物的京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路进行分析发现,显著富集的通路只有组氨酸代谢(P<0.05)。综上可知,在本试验条件下,不同磷源对于奶牛泌乳性能无显著影响,TCP可能提高了奶牛对磷的利用率,且上调了血浆中与抗氧化和抗炎相关的代谢物,对奶牛健康有积极影响。

摘要：植物长末端重复(long terminal repeat,LTR)逆转座子具有普遍性、高拷贝、高异质性和插入多态性,适合开发成分子标记。本研究从栽培种花生(Arachis hypogaea)基因组中获得Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因序列,分析其特点和差异,为基于LTR逆转座子的分子标记开发奠定基础。利用根据Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因保守区设计的简并引物对栽培种花生‘桂花1026’品种的基因组DNA进行PCR扩增,目的条带经回收、克隆和测序后,对获得序列进行生物信息学分析。克隆到27条逆转录酶基因序列,序列长度皆为432 bp,AT所占比例为55.32%~66.90%,AT与GC比值为1.24~2.02,核苷酸序列间相似性为44.90%~98.80%,呈现较高异质性;聚类分析后,27条基因序列分为3个家族,家族Ⅰ是主要成分;27条编码蛋白序列的基因中有10条发生了无义突变;基因编码蛋白序列间相似性为34.50%~97.90%,呈现高度异质性;除AhRT2-4外,各基因编码蛋白序列间保守基序完全一致;对栽培种花生和其他物种植物的Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列构建系统进化树,进化树显示所有序列被分为6类,其中,Ⅰ类包含19条其他植物物种和1条栽培种花生的序列,Ⅱ类包含8条其他物种和7条栽培种花生的序列,表明栽培种花生逆转录酶序列具有较高的保守性,栽培种花生逆转录酶基因编码蛋白序列与绿豆(Vigna radiata)、枣(Ziziphus jujuba)、黄瓜(Cucumis sativus)、油棕(Elaeis guineensis)、火龙果(Hylocereus undatus)等植物的逆转录酶序列亲缘关系较近,表明不同植物的Ty3-gypsy逆转座子之间可能存在着水平基因转移;通过比对花生EST数据库,发现了4条具有转录活性的栽培种花生Ty3-gypsy类逆转座子。本研究所获得的逆转录酶基因序列可为栽培种花生Ty3-gypsy逆转座子的分子标记开发利用及分子育种奠定一定基础。

摘要：旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)的方法,并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列,在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列,应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法,并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果,本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒,且无交叉反应。灵敏性结果显示,本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线,其曲线呈良好的线性关系(R2=0.9994),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测,结果显示2种方法AEV阳性检出率均为4.62%(3/65)。结果表明,本研究建立的ddPCR方法检测AEV特异性高、灵敏好和稳定可靠,为绝对定量检测AEV提供了技术手段,对有效防控AEV有重要意义。

摘要：【目的】探究甘蔗根系响应水分变化的碳氮代谢生理应答机理,为后续研究甘蔗的抗旱性和高产栽培研究提供参考。【方法】以新台糖22号为试验材料,在大棚中采用桶栽方式,模拟自然干旱胁迫过程,在处理开始后第0、1、3、5、7、9、11、15、19和25 d采样并测定土壤水含量及甘蔗根系的水含量、碳水化合物和氮同化产物含量及关键酶活性,分析各项指标干旱胁迫后的动态变化趋势。【结果】干旱胁迫下,甘蔗根系水含量逐渐降低,至干旱胁迫第25 d时,根系水含量降至19.42%,较第0 d(75.64%)时降低56.22%(绝对值)。随着干旱胁迫时间的延长,氮代谢中脯氨酸和游离氨基酸含量随着干旱程度的加重而逐渐增加,于干旱处理第25 d时均达最高值,分别为85.69和20.08 mg/gFW,而硝酸还原酶活性变化呈前期降低、中期升高、后期又逐渐下降的波动变化趋势。碳代谢中的可溶性糖含量波动升高,干旱胁迫第19 d时达最高值(4.47 mg/gFW),干旱胁迫第25 d时出现回落;淀粉含量与可溶性糖含量变化趋势相反,干旱胁迫第25 d时淀粉含量降至最低值(0.55 mg/gFW),但淀粉酶活性逐渐升至最高值[18.15 mg/(gFW·min)]。【结论】干旱胁迫下甘蔗根系通过调节碳氮代谢关键酶活性、碳水化合物和氮同化物含量从而避免干旱对根系的伤害,保障甘蔗正常生长发育,但根系只能在一定时间范围内抵御干旱胁迫造成的伤害,因此需要在干旱初期阶段做好防范措施。

摘要：本试验旨在研究低蛋白质饲粮中添加发酵菜籽粕替代豆粕对育肥猪生长性能、胴体性状和肉品质的影响。试验采用单因素随机试验设计,选取36头体重为(60±2)kg的杜×(长×大)三元杂交猪,按性别随机分配至3个试验组,每组6个重复,每个重复2头猪(公母各占1/2)。其中,对照组和低蛋白质组饲喂玉米-豆粕型饲粮,粗蛋白质含量分别为14.03%和11.79%;低蛋白质-发酵菜籽粕组饲粮以发酵菜籽粕替代50%的豆粕,饲粮粗蛋白质含量为11.81%。试验猪体重达到110 kg时结束饲养试验并对所有猪实施屠宰取样。结果表明:1)与对照组相比,各试验组的生长性能和胴体性状无显著差异(P>0.05)。2)与对照组相比,低蛋白质组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性显著提高(P0.05)。4)与对照组、低蛋白质组相比,低蛋白质-发酵菜籽粕组趋于提高背最长肌风味(P=0.075);与低蛋白质组相比,低蛋白质-发酵菜籽粕饲粮显著降低了肉汤浑浊度(P0.05)。6)各试验组间总脂肪酸含量无显著差异(P>0.05),但与对照组相比,低蛋白质-发酵菜籽粕组油酸含量、单不饱和脂肪酸含量均显著提高(P<0.05);亚油酸、二十烷二烯酸含量及多不饱和脂肪酸含量均显著下降(P<0.05)。综上所述,在低蛋白质饲粮的基础上使用发酵菜籽粕部分替代豆粕,对60~110 kg阶段育肥猪的生长性能和胴体性状无负面影响,但可显著提高猪肉的肌苷酸含量和感官评分,并具有改善猪肉脂肪酸组成的作用。