摘要：建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的扩增温度、引物浓度和反应时间,通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测,验证鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。结果显示,鸡GyV3 LAMP检测方法的反应体系:总体积为20.0μL,包括DNA模板1.0μL,2×Master Mix 10.0μL,内引物GyV3-FIP和GyV3-BIP混合液(工作浓度16.0μmol/L)2.0μL,外引物GyV3-F3和GyV3-B3混合液(工作浓度2.0μmol/L)2.0μL,环引物GyV3-LF和GyV3-LB混合液(工作浓度8.0μmol/L)2.0μL,ddH_(2)O 3μL;鸡GyV3 LAMP检测方法的扩增程序:66℃反应20 min,80℃灭活5 min。鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数小于5%;与常规PCR方法检测临床样品的结果比较,两者结果符合率达100%。建立的鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,具有特异性好、敏感性高及污染小等优点,且检测结果可通过肉眼观察进行判断,适用于GyV3的临床快速筛查。

摘要：A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55 ku左右的特异蛋白条带(感染后9 h),将该55 ku左右的蛋白条带切胶回收后进行质谱分析,根据质谱分析的筛选标准选择蛋白得分(Mass score)较高、谱图数(Matches)和序列数(Sequences)较为可信的宿主因子DBNL作为调控IAV复制的潜在研究对象进一步研究。本研究针对DBNL设计特异的siRNA和对照Scrambled siRNA,将其分别转染A549细胞,通过荧光定量PCR确定DBNL siRNA在转录水平的干扰效果显著;利用细胞活力测定试验确定DBNL siRNA的干扰不影响细胞活力。利用DBNL siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染该细胞,在感染后24 h、48 h分别收集细胞上清,利用MDCK细胞进行噬斑滴定试验。试验结果显示,与对照组相比,下调表达DBNL后IAV的滴度极显著降低(P<0.01),表明下调表达DBNL能够抑制A549细胞中的IAV复制。利用siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后6 h,对照组中红色荧光集中分布在细胞质中,而DBNL siRNA组中红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明下调表达DBNL能够抑制细胞中IAV NP蛋白的出核。反之,通过转染过表达DBNL的重组质粒,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后4 h,转染pCAGGS的对照组中红色荧光主要分布在细胞核中,而过表达DBNL组中的红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明过表达DBNL能够促进细胞中IAV NP蛋白的出核。以上研究结果证实DBNL正调控IAV的复制与其NP蛋白的出核。本研究丰富了DBNL功能的多样性,为宿主因子调控IAV复制的研究提供参考数据。

摘要：本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测过表达KTR2蛋白对流感病毒复制影响,结果显示,过表达KRT2蛋白后流感病毒滴度和NP蛋白表达均下降;激光共聚焦试验检测结果显示,过表达KRT2蛋白后,流感病毒复制早期NP蛋白向细胞核内的聚积受到了抑制。针对KRT2基因设计特异性siRNA-1/2,转染A549细胞后采用细胞活力检测试剂盒检测下调KRT2蛋白表达后对A549细胞活力影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测干扰效率,筛选最佳siRNA,结果显示,与对照siRNA相比,KRT2特异性siRNA处理不影响A549细胞活力,且siRNA-2能更有效降低KRT2的表达。以A/WSN/1933(H1N1)株病毒感染siRNA-2转染后的A549细胞,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测siRNA-2干扰下调KTR2蛋白表达对流感病毒复制影响,上述试验结果均显示,KRT2表达下调后病毒滴度和NP蛋白表达均显著提高;激光共聚焦试验结果显示,下调KRT2蛋白表达后,流感病毒在复制早期阶段受到了抑制。本研究结果首次表明,KRT2是一种负调控流感病毒复制的宿主因子。本研究丰富了流感病毒与宿主因子互作的网络,也深化了对宿主因子影响流感病毒复制机制的认知。

摘要：核蛋白(NP)是流感病毒的主要结构蛋白,其与RNA依赖性的聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)及vRNA构成核糖核蛋白复合体,参与流感病毒复制过程中的多个阶段。宿主因子着丝粒蛋白V(CENPV)在细胞生命周期中发挥重要作用,但是目前尚未见关于CENPV蛋白与流感病毒NP蛋白相互作用的报道。为研究宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白相互作用机制,本实验利用酵母双杂交技术筛选与NP蛋白相互作用的CENPV,利用酵母回交验证,结果显示CENPV与NP诱饵质粒共同转化Y2H酵母感受态细胞,在DDO、QDO和QDO/X/A 3种营养缺陷型的培养基上均能生长,并使菌落呈现蓝色,与阳性对照结果一致,而阴性对照组在QDO和QDO/X/A培养基上均未观察到菌落,表明在酵母系统中宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用。将pCAGGS-CENPV-Myc(1μg)表达质粒与pCAGGS-NP(1μg)质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)检测,结果显示鼠抗NP MAb仅可结合CENPV与NP共转染组中的CENPV,表明宿主蛋白因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在相互作用;进一步利用激光共聚焦试验检测,结果显示在A549细胞中宿主因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在共定位。根据人CENPV序列设计合成CENPV的特异性siRNA,利用RNAiMAX将CENPV siRNA转染A549细胞,48 h后进行细胞活力测定和病毒感染试验,结果显示利用siRNA干扰技术下调CENPV表达后对细胞活力无影响,但可促进流感病毒在A549细胞中的复制。以上研究结果首次证实宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用,并且调控流感病毒的复制。本研究进一步完善了流感病毒NP蛋白与宿主因子的相互作用网络,为宿主因子调控流感病毒复制研究提供参考。

摘要：【目的】优化桂糖42号甘蔗的种植密度和施肥水平,明确其高产综合配套栽培模式,为该品种在生产上进一步推广种植提供参考依据。【方法】采用五元二次正交旋转组合设计,建立产量与下种量、氮磷钾施肥量和行距的二次多项式回归模型,分析桂糖42号的高产优化方案。【结果】以设计编码和桂糖42号甘蔗产量建立二次多项式回归模型得到的回归方程拟合较好,说明该回归方程可较好地反映产量与栽培因子间的关系。试验因子效应分析结果表明,种植行距和下种量对桂糖42号产量贡献较大,其次是氮肥和钾肥水平,磷肥水平的贡献较小;在试验设计的水平范围内,甘蔗产量随种植行距的增大而降低,在低水平时随下种量和施肥量的增加而提高,在高水平时随下种量和施肥量的增加而降低。边际效应及栽培方案优化分析结果表明,以90.00 t/hm^2为目标产量的桂糖42号优化栽培方案为:下种量120525~122025芽/hm^2,施用氮肥364.0~380.0 kg/hm^2、磷肥164.0~179.0 kg/hm^2、钾肥244.0~256.0 kg/hm^2,种植行距0.8~0.9 m;获得最佳经济效益时对应的优化方案为:下种量112500芽/hm^2,施用氮肥360.0 kg/hm^2、磷肥180.0 kg/hm^2、钾肥270.0 kg/hm^2,种植行距1.2 m。【结论】在中等土壤肥力条件下,桂糖42号在下种量112500芽/hm^2、种植行距1.2 m及氮、磷、钾肥施用量分别为360.0、180.0和270.0 kg/hm^2时可获得较佳的经济效益。

摘要：为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRNA对细胞活力的影响。结果表明siTRIM74-331的干扰效率较好且不影响细胞活力。将siTRIM74-331转染A549细胞后感染禽流感病毒(AIV)A/WSN/1933株(WSN),并于感染后24 h、48 h分别进行噬斑滴定,结果显示干扰TRIM74的表达可抑制流感病毒的复制。利用慢病毒包装系统构建TRIM74过表达细胞系(A549-pLVX-TRIM74)和对照细胞系(A549-pLVX),并经qPCR及western blot鉴定正确后,将WSN株(MOI 0.01)分别感染上述两种细胞,并于感染后24 h、48 h收集细胞上清分别进行噬斑滴定。结果表明,过表达TRIM74能够显著促进流感病毒的复制。将WSN株(MOI 5)分别感染A549细胞和HEK293T细胞后,分别采用qPCR和western blot检测细胞中内源TRIM74的转录及蛋白表达水平,结果表明WSN能够刺激细胞内源TRIM74的转录与表达,推测宿主细胞可能通过增强TRIM74的表达响应流感病毒的感染。为探究TRIM74在宿主细胞天然免疫反应中发挥的作用,将不同剂量的表达质粒pTRIM74-V5转染HEK293T细胞,经western blot确定其能够在细胞中呈剂量依赖性表达后,将上述剂量的p TRIM74-V5与p RL-TK、pIFN-β-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞(1组);同时将上述剂量的pTRIM74-V5与p RL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T(2组),24 h后感染仙台病毒(SeV),12 h后采用双荧光素酶试验检测过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响。结果显示,转染空载体的对照细胞在感染SeV后上述两种启动子的活性均升高,而1组和2组细胞中该两种启动子的活性均极显著下降,且随pTRIM74-V5转染量的升高二者的活性均呈下降趋势。分别将SeV和poly(I:C)刺激TRIM74过表达及干扰其表达的HEK293T细胞,12 h后采用q PCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56 mRNA的转录水平。结果显示,TRIM74过表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞;干扰TRIM74表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著或者显著高于转染NC siRNA的阴性对照细胞,表明TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌。本研究结果首次表明TRIM74能够促进流感病毒的复制,并负调控宿主细胞中IFN-β信号通路,该研究丰富了流感病毒与宿主因子间的调控网络,为深入了解TRIM74蛋白的功能奠定了实验基础。

摘要：本试验旨在研究不同储存时间小麦在猪上的消化能和营养物质消化率。试验于2016年在河北省国家粮仓分别采集2012、2013、2014、2015和2016年收获的小麦样品。试验1:选取30头初始体重为(45.2±1.5)kg杜×长×大三元杂交健康去势公猪,采用全收粪法测定5个小麦样品的消化能和营养物质表观全肠道消化率。试验2:选用6头初始体重为(32.6±1.2)kg装有简单T型瘘管的杜×长×大三元杂交健康去势公猪,采用6×6拉丁方试验设计,测定5个小麦样品中氨基酸的表观和标准回肠消化率以及淀粉的表观回肠消化率。结果表明:储存时间显著影响小麦的消化能以及总能、粗蛋白质和中性洗涤纤维表观全肠道消化率(P<0.05)。2012—2016年小麦对生长猪的消化能分别为14.16、14.11、14.06、14.43和14.06 MJ/kg。2015年小麦的消化能以及总能和中性洗涤纤维表观全肠道消化率显著高于其他年份小麦(P<0.05),2015年小麦的粗蛋白质表观全肠道消化率显著高于2014和2016年小麦(P<0.05)。从氨基酸表观和标准回肠消化率来看,2015年小麦多种氨基酸的表观和标准回肠消化率均处在较高水平。综上可知,以河北省国家粮仓储存的小麦为研究对象,储存1年后对于生长猪的营养价值最佳,其后随储存时间延长,小麦的营养价值降低。

摘要：【目的】研究制备一种新型抗菌肽——生泰素奶牛成膜型后药浴液,对其有效性和安全性进行表征。【方法】运用单因素影响试验及L 9(3)3正交试验筛选生泰素奶牛后药浴液最优配方;运用体外杀菌试验表征杀菌有效性;通过溶血性试验、细胞毒性试验、单次给药小鼠皮肤刺激性试验、多次给药小鼠皮肤刺激性试验及小鼠皮肤致敏性试验验证安全性。【结果】正交试验结果显示,以7%的成膜剂PVA1788为基质配制膜溶液,甘油的试验影响最大,其次为吐温80;生泰素奶牛后药浴液的最优配方为:增塑剂甘油的最优添加体积分数为4%,表面活性剂吐温80的最优添加体积分数为1%,增稠剂普鲁兰多糖的最优添加质量百分浓度为0.4%。生泰素奶牛后药浴液在30 min内可杀灭99.999%以上供试金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌,杀菌效果与聚维酮碘相当。生泰素奶牛后药浴液溶血性和细胞毒性均低于聚维酮碘后药浴液。单次和多次小鼠皮肤刺激性试验及皮肤致敏性试验结果显示,生泰素奶牛后药浴液对小鼠皮肤无刺激性和致敏性。【结论】生泰素奶牛后药浴液是一种制备工艺简单、有效、绿色、安全的成膜型后药浴液,预期能有效预防奶牛乳房炎的发生,保证原料乳的质量安全,促进乳品行业健康发展。

摘要：【目的】设计生物农药与生物质发酵肥配合施用,研究对烟草根结线虫病害具有显著防控效果和环境友好型的措施。【方法】选取根结线虫危害较重的烟田,用3种生物农药与4种生物质发酵肥的不同组合,分别在栽前、栽后45、90 d及采烤结束的土壤进行取样并检测J2数量;调查病情指数;测定产量和测评产值。【结果】根际土壤中在栽前与采烤结束时的各处理间J2数量差异不显著,栽后45 d差异极显著,栽后90 d差异显著;综合防控各处理间病情指数差异极显著,肯邦线尊和丁硫甲维盐分别与油萝卜秸秆发酵肥配合施用,及发酵肥单独施用的防控效果较好,相对防效达50.4%~67.1%;减少复混肥施用量28.9%,产量增加531~744 kg/hm^2,产值增加16890~23694元/hm^2。【结论】育苗末期、栽前和团棵期分别将阿维菌素类生物农药与油萝卜秸秆发酵肥配施,减少复混肥施用量28.9%,可有效防控烟草根结线虫病害,产量与产值显著提高。

摘要：本试验研究了白藜芦醇(RES)对两种类型底物瘤胃发酵的甲烷(CH 4)排放、养分降解以及微生物区系影响,旨在探索RES调控瘤胃发酵、降低CH 4排放的机理。本试验为双因素设计,选取3只健康、体重相近((50±2.3)kg)且安装有永久性瘤胃瘘管的杜寒杂交肉羊做为瘤胃液供体。试验一,在精粗比为68∶32(高精料,HC)和28∶72(高粗料,HF)的两种底物中分别添加0%(对照组)、7.7%、14.3%和25.0%的RES进行产气试验,并选取对照组和14.3%组进行16S扩增子高通量测序;试验二,在上述两种底物中分别添加0%、14.3%的RES进行降解率试验。以上试验处理均设置5个重复。试验结果如下:1)两种底物产气量(GP)和CH 4产量随RES水平的增加均线性降低(P<0.05);在相同RES处理下,相较HC,HF中GP和CH 4产量均显著降低(P<0.05);且两因素对两指标变化存在交互效应(P<0.05)。2)添加RES后两种底物干物质(DM)、有机物(OM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)降解率均显著降低(P<0.05);在相同RES处理下,相较HC,HF中各养分降解率均显著降低(P<0.05),且两因素对发酵24 h中性洗涤纤维降解率(NDFD)和酸性洗涤纤维降解率(ADFD)存在交互作用(P<0.05)。3)从门水平来看,两种底物中添加RES均引起变形菌门(Proteobacteria)丰度显著升高(P<0.05);相较HC,HF的变形菌门丰度显著升高(P<0.05)。另外,在发酵第24小时,HF中添加RES添加导致互养菌门显著降低(P<0.05);发酵第12小时,同一RES处理水平下,相较HC,HF中放线菌门丰度显著降低。从属水平来看,添加RES和改变底物类型均导致Prevotella_1(普雷沃氏菌_1)丰度大幅下降,且在HC(发酵12 h)、HF(发酵24 h)具有统计学意义(P<0.05);添加RES变形菌门的优势菌属Ruminobacter和Succinivibrio均显著增加(P<0.05)。另外,发酵第12小时,在HF添加RES,Rikenellaceae_RC9_gut_group、Prevotellaceae_NK3B31_group和Christensenellaceae_R-7_group丰度均显著上升(P<0.05);相较HC,HF中Prevotellaceae_UCG-001、Prevotellaceae_NK3B31_group和Christensenellaceae_R-7_group丰度显著降低(P<0.05)。在发酵第24小时,在HF中添加RES导致Veillonellaceae_UCG-001和Lachnospiraceae_XPB1014_group丰度显著降低(P<0.05),Prevotellaceae_UCG-001、Phocaeicola、Prevotellaceae_NK3B31_group、Succiniclasticum、Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group和Ruminobacter丰度显著升高(P<0.05);且两因素对普雷沃氏菌_1、Succiniclasticum、Veillonellacea e_UCG-001和Lachnospiraceae_XPB1014_group的丰度变化存在互作效应(P<0.05)。此结果说明,添加高水平的RES可以有效降低瘤胃环境CH 4的排放量,但是抑制了各养分在瘤胃中的降解,这可能与瘤胃菌群中普雷沃氏菌_1的大幅度下降有关。