摘要：【目的】研制禽致病性大肠杆菌菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因的核酸疫苗,并评估其在鸡体内的免疫保护效果。【方法】以鸭源鸡杆菌的菌毛基因flfA为目的基因,采用携带鸡β肌动蛋白启动子的pCAGGS-HA质粒作为表达载体,构建pCAGGS-flfA真核表达质粒;构建温控质粒PBV-E-SN,并将其转化至对氨苄青霉素敏感的禽致病性大肠杆菌分离株制备菌影;将pCAGGSflfA质粒装载入菌影制备菌影疫苗,设计菌影负载pCAGGS-flfA质粒组、pCAGGS-flfA质粒组、空菌影组、PBS组及正常对照组。对7日龄雏鸡进行首次免疫,首免2周后二次加强免疫,首免4周后对鸡进行鸭源鸡杆菌攻毒试验,检测疫苗的免疫保护效果。【结果】所构建的真核表达质粒pCAGGS-flfA能在体外细胞中成功表达;构建的禽致病性大肠杆菌菌影菌株在42℃热诱导210min后,裂解率达到99.94%;免疫保护试验结果显示,无论是通过ELISA检测的特异性IgG抗体水平,还是对鸡泄殖腔拭子和咽拭子的排菌情况以及组织脏器中细菌载量的测定,菌影负载pCAGGS-flfA质粒组的免疫保护效果均显著高于其他免疫组,包括单独免疫pCAGGS-flfA质粒组。与单独免疫pCAGGS-flfA质粒组相比,菌影负载pCAGGS-flfA质粒组的免疫保护效果更为优越。【结论】本研究表明菌影作为pCAGGS-flfA的负载载体显著增强了该核酸疫苗的免疫保护效果。

摘要：猪星状病毒(porcine astrovirus,PAstV)属于星状病毒科,是哺乳动物星状病毒属家族成员,临床上主要引起仔猪呕吐、腹泻等症状,且常与其他病原混合感染。PAstV衣壳蛋白(capsid protein,Cap)与宿主细胞受体结合,诱导机体产生中和抗体,是开发PAstV疫苗的靶蛋白。为制备抗猪星状病毒5型衣壳蛋白的兔源多克隆抗体,本研究通过DNA Star软件对PAstV5 Cap进行抗原性分析,选择出抗原优势区域ORF2开放阅读框1~642 bp(642 bp),构建原核表达质粒pET32a-Cap-642,测序结果正确后将其转化至大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为43 ku。重组蛋白经尿素透析法纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。间接ELISA方法测定多克隆抗体效价为1∶51 200,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果显示抗PAstV5 Cap多克隆抗体能够特异性地识别PAstV5感染猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)中表达的天然抗原;同时将抗PAstV5 Cap多克隆抗体进行了初步应用,结果表明该多抗具有良好反应性。本研究为PAstV5检测方法的建立以及PAstV5衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。