摘要：样点识别是生物芯片信息处理的基础。本文通过分析基因芯片的图象特征,提出了基于变形模板技术的基因芯片杂交样点自动识别方法。以芯片设计点样阵列为模板,建立了芯片杂交样点的变形模板模型,用多个参数表征了模板的平移、旋转和缩放。结合图象的特征设计了变形模板的能量函数,采用遗传算法搜索变形模板,实现了变形模板与杂交样点的最佳匹配。实验结果表明,该方法具有很好的稳健性和较快的收敛速度,能够准确识别杂交样点。

摘要：利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针,并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料,而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果,证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×10^1拷贝/反应,相比于巢式RT-PCR方法,其灵敏度高10-100倍以上。在对54份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。

摘要：SNP位点选择是是国境口岸致病微生物基因芯片检测探针设计的关键环节,目前主要依靠手工完成,严重影响着检测速度和检测质量。我们提出了一种基于遗传算法的SNP位点的自动选择方法,该方法运用粗糙集理论评估SNP位点组合的分类能力,综合与检测实验密切相关的设计指标,采用遗传算法进行优化搜索。实验结果表明,该方法具有很好的稳健性和较快的收敛速度,能够准确地寻找致病微生物的SNP位点组合,为大规模的检测基因芯片探针自动设计提供了快速可靠的途径,缩短了国境口岸致病微生物的检测时限,提高了检测结果的准确性。

摘要：根据啤酒花潜隐类病毒(HpLVd)各分离物基因序列,设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,建立了对HpLVd的实时荧光RT-PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了HpLVd的实时荧光RT-PCR最佳反应条件:Mg2+终浓度为5.5 mmol/L,引物终浓度为0.7μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L。灵敏度对比试验结果显示,实时荧光RT-PCR的灵敏度较普通RT-PCR通过琼脂糖凝胶电泳高10倍,在25μL反应体系中,总RNA含量达到20 pg就能通过实时荧光RT-PCR检测出来。此方法也能成功检测田间样品上的啤酒花潜隐类病毒。

摘要：现有的动物疫病诊断技术多是针对单一病原检测,而动物疫病的流行通常是多种病原混合感染,目前的诊断技术不能很好地满足国境口岸快速、高通量检疫的需求,一直以来多重检测技术的研究是动物疫情监测、疫病控制领域关注的焦点。本试验在前期猪病混合感染诊断研究基础上,进一步利用多重连接探针扩增(MLPA)技术,以蓝舌病病毒(BTV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛地方流行性白血病病毒(EBLV)和口蹄疫病毒(FMDV)为研究对象,分别设计这5种牛病毒的MLPA探针,将这5种探针混合,建立可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。特异性试验表明:每种病毒的探针都是特异的,只能识别各自的目的片段,不能扩增出其他相关病毒,探针之间也不存在交叉反应;敏感性试验结果表明:5重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸的2 000个拷贝。经过对136份临床样品的检测,该方法与现有荧光PCR方法的符合率达到100%,能够正确地检测出每份阴、阳性样品及混合感染样品。本研究建立的5种病毒MLPA检测方法可以实现1次采样,1次分析,同时检测5种牛病毒的目的,该技术特异性强、敏感性高,加之其多重性检测的优势,有望成为未来疫病检测的新方向。

摘要：建立多重串联式PCR(MT-PCR)的基因碟片技术用于转基因大豆GTS40-3-2的检测。针对GTS 40-3-2的常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、Ca MV35S启动子和大豆内源基因Lectin设计引物,同时针对外源基因插入位点的旁临序列设计品系特异性引物。首先进行一次循环数较少(15 cycles),引物浓度较低(0.1μmol/L)的高通量多重PCR,以均匀地扩增各基因模板,同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因。根据熔融曲线分析结果,灵敏度高于普通荧光定量PCR法1个数量级。该方法能够快速、高通量、准确地检测转基因大豆GTS40-3-2中的多种转基因成分,并能对该品系进行分析,重复性好,适合转基因的高通量、定量检测,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2,具有较好的应用价值。

摘要：根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法。同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断。特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致。

摘要：根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。

摘要：目的建立一种快速检测豆类及其制品中肠出血性大肠杆菌O157、O104的双重real-time PCR方法。方法分别选取大肠杆菌O157的特异性基因rfbE和大肠杆菌O104的特异性基因wzy作为靶基因,设计相应的特异性引物探针,建立双重real-time PCR反应体系,并对反应体系及引物浓度等反应条件进行优化。结果最终确定反应体系为:以大肠杆菌O157、大肠杆菌O104菌株的DNA按照1∶3比例混合作为模板,模板DNA 2μL,Master Mix 12.5μL,上游引物(10μmol/L)各1μL,下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)各0.5μL,灭菌水补齐至25μL。实现了同一次处理样品在同一反应体系中同时检测肠出血性大肠杆菌的两种血清型,检测灵敏度的下限可达102CFU/m L(g)。结论该方法特异性好,对其他常见病原菌无扩增,灵敏度高、快速、简便,为食源性致病菌的检测提供了理想手段。

摘要：目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素基因hlyA、内化素基因inlA和磷脂酶C基因plcB的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测方法,并对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB基因进行了检测,分析3个毒力基因在多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)聚类群组中的分布情况。方法根据单增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA和plcB的保守序列设计引物和小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针建立三重荧光PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行了测试,并对分离的101株单增李斯特菌进行三重PCR检测。结果建立的三重实时荧光PCR方法特异于单增李斯特菌的检测,重复性良好,组内Ct值变异系数均小于1.5%,灵敏度可达100CFU/mL。对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB的检出率分别为98%、75%和98%。在可被MLST分型的89株菌株中,groupI的30株菌株有20株均缺失inlA基因;groupII的57株菌株中有56株三个基因均检出;groupIII的菌株hlyA、inlA和plcB三个基因均未检出。结论本文建立的三重实时荧光PCR方法能准确、快速、稳定的检测单增李斯特菌,101株单增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB三个毒力基因的检出情况与单增李斯特菌的MLST分型聚类有较一致的关系,对分析单增李斯特菌毒力的强弱有重要参考意义。