摘要：自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是机体免疫功能紊乱所引起的溶血性贫血，主要由于体内存在自身抗体而诱发。近年有研究发现AIHA病人的T细胞激活有异常[1,2]，但有关资料甚少。本文利用RT-PCR和基因扫描(Genescan)等方法分析T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因互补决定区3(CDR3)的长度，从而了解2例AIHA病人TCR Vβ各亚家族T细胞的分布和克隆性特点。1 材料与方法1.1 标本 经溶血性贫血有关检查等确诊的AIHA和Evans综合征各1例，正常人10例，T细胞株Molt-4和Jurkat作为对照。外周血单个核细胞分离、RNA提取及cDNA合成均按常规方法进行。1.2 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据Vβ24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物[3]。每一标本分别以一Vβ(1～24)与Cβ引物共进行24次PCR检测。PCR操作按已报道方法进行[4,5]。1.3 基因扫描分析(T细胞克隆性分析)1.3.1 标记PCR产物(runoff reaction) 采用一荧光素标记引物Cβ-Fam(位于Cβ内侧)进行不对称半巢式PCR扩增，将首次PCR产物标上荧光素(fam)。总反应体积为10μl，其中包括2μl首次PCR产物，0．1μmol/L Cβ-Fam，3 mmol／L MgCl2，0．2 mmol/LdNTP,0．25U Taq聚合酶，PCR操作按已报道方法进行[4,5]。1.3.2 基因扫描(Genescan)分析 由于Vβ和Cβ引物是固定的，故Vβ/Cβ所扩增的PCR产物的大小决定于Vβ区和Dβ区之间以及Dβ区和Jβ区之间重排时的连接片段N区，即VβNDβNJβ(CDR3)，不同的T细胞克隆的PCR产物长度和浓度不同，通过PCR产物的状况，便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过自动序列分析仪(373A DNA序列仪，ABI，PE公司)中的分析软件672即基因扫描分析，通过电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量；峰的形态提示产物的均一性即克隆性，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，在电泳过程中，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，即提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性。有关操作步骤按使用指南进行。取标记的PCR产物1μl，加入2．5 μl甲酰胺，0．5μl标准品[ABI，GENESCAN,500-TAMRA，其中含有不同大小的用荧光素Tamra标记的DNA片段作为产物大小的参照物]及0．5μl加样缓冲液(葡聚糖兰50mg／ml，EDTA25mmol／L)，于94℃，4 min变性后于6％聚丙酰胺凝胶，373ADNA序列分析仪中电泳及分析结果[4,5]。2 结果2.1 RT-PCR扩增结果 正常人T细胞包含几乎全部的Vβ亚家族T细胞；Molt-4仅表达Vβ2、Jurkat仅表达Vβ8的T细胞[4,5]，AHA病人的T细胞中仅存在Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ13、Vβ16和Vβ24等6个亚家族的T细胞；而Evans综合征病人的T细胞中则存在Vβ3、Vβ13和Vβ16等3个亚家族T细胞。2.2 基因扫描分析结果 正常人所有PCR产物均呈多峰图象，提示为多克隆性[5]；T细胞株的产物则为单克隆性；而所检测的2例病人中的Vβ3PCR产物均呈寡克隆性，Vβ16的PCR产物均呈双克隆性，其它的产物均提示为多克隆性(图1)。