摘要：目的 评估本实验室设计的肺部常见病原真菌real-time PCR检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)标本对非中性粒细胞缺乏的老年人群肺部真菌病的诊断价值。方法 回顾性纳入2020年至2021年间于北京大学第一医院就诊的怀疑肺部感染的294名非中性粒细胞缺乏老年患者,采用real-time PCR检测其BALF标本中的病原真菌;根据宿主因素、临床表现和真菌学检查进行诊断分类,27名患者符合确诊或临床诊断的肺部侵袭真菌病,其中7例(25.6%)为多种真菌合并感染,6名患者诊断慢性肺曲霉病。结果 曲霉PCR Ct值受试者工作特征曲线下面积为0.936(95%置信区间0.865~1.000),最佳cut-off值为34.8,对肺曲霉病的诊断灵敏度和特异度分别为95.7%和92.1%。耶氏肺孢子菌PCR以Ct值37.1为cut-off值,诊断耶氏肺孢子菌肺炎灵敏度和特异度分别为94.7%和99.7%。隐球菌和毛霉PCR以Ct值35.0为cut-off值,在肺隐球菌病和肺毛霉病中阳性率分别为50%(2/4)和100%(1/1)。病原真菌real-time PCR确定cut-off值后,以PCR检出的真菌与肺部真菌病的致病真菌一致作为阳性,灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为86.5%(32/37)、91.0%(253/278)、56.1%(32/57)和98.1%(253/258),总符合率为90.5%(285/315)。结论本研究团队开发的病原真菌real-time PCR体系覆盖常见肺部致病真菌,初步探索了其在BALF标本中的cut-off值,证实该方法在非中性粒细胞缺乏老年患者的肺部真菌病中具有良好的诊断价值。

摘要：随着免疫低下患者的增加 ,真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。本文简要综述了 10年来本中心的工作概况 ,包括 (1)致病菌种的收集与保藏 :目前已收集国内外致病真菌 2 6 0 0余株 ,发现并报道国内外致病菌新纪录种多株 ,如多变根毛霉规则变种、葡萄孢维郎那霉致病新纪录种 ,报道多例国内致病新纪录种如棘状外瓶霉、奔马赭霉、疣状瓶霉、草本枝孢霉等引起的暗色丝孢霉病等 ;(2 )流行病学研究 :通过对院内真菌感染菌种及危险因素分析 ,及时监测致病菌种的变迁及危险因素的变化 ;(3)致病种的分类研究及新菌种的鉴定 :应用RAPD、RFLP、序列分析等方法对近 10个属的致病真菌进行了分类、鉴定并命名了 3个曲霉新种 ,并对致病新纪录种的生物学特性进行了研究 ;(4 )真菌病诊断 :设计出曲霉、外瓶霉、孢子丝菌的种特异性引物 ;应用免疫组化、原位杂交等技术对深部真菌病进行了诊断研究 ,设计烟曲霉种特异性探针并成功地对可疑曲霉感染进行了诊断 ;(5 )真菌病发病机制及耐药机制研究 :通过小鼠模型 ,应用简并引物RT PCR技术、克隆测序、Northern杂交等方法 ,发现了烟曲霉潜在的毒力因素———组氨酸激酶 ;应用Southern杂交、RFLP、SSCP等技术分析 。

摘要：目的建立侵袭性真菌病的实时荧光定量PCR诊断方法，初步评价其在侵袭性真菌病诊断中的价值。方法设计真菌通用、曲霉和念珠菌的属特异性引物和TaqMan探针，检测标准菌株和部分临床分离株，探讨这3个检测体系的敏感性和特异性。收集确诊或除外侵袭性真菌病的21例患者的血清标本，验证实时荧光定量PCR诊断方法在临床诊断中的准确性。结果3个检测体系实现了在相同PCR条件下的整合。真菌通用检测体系能检测大部分病原真菌，包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、多变根毛霉、少根根霉以及马内菲青霉；曲霉检测体系能检测烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉；念珠菌检测体系能检测白念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌。真菌通用检测体系能检测到4pg基因组DNA，曲霉和念珠茵的检测体系均能检测到2个拷贝数。11例侵袭性真菌病患者的11份血清标本经该诊断体系检测，结果与传统方法的诊断结果完全吻合，且3个检测体系之间有很好的一致性，其中2例侵袭性曲霉病和2例侵袭性白念珠菌病均被鉴定至属，其他7例患者亦可通过真菌通用检测体系被诊断为侵袭性真菌病。10例除外侵袭性真菌病患者的10份血清均无扩增。结论建立的真菌通用检测体系能检测临床常见的深部病原真菌，且曲霉和念珠菌检测体系能进一步将临床常见的曲霉和念珠菌鉴定至属的水平。

摘要：目的克隆希木龙念珠菌中药外排泵基因(CDR1),为探讨希木龙念珠菌的耐药机制奠定基础。方法首先从NCBI基因数据库中找到已知的白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌Cdr1蛋白的氨基酸保守序列,并设计简并引物,PCR扩增获得希木龙念珠菌CDR1c DNA部分片段,接着使用RACE方法分别扩增其5'和3'端序列得到完整的CDR1编码序列(CDS)。结果简并PCR扩增得到预期2 210bp大小的片段;5'RACE和3'RACE分别得到CDR1c DNA 5'和3'端片段,经纯化、克隆、测序、比对和拼接分别得到两株菌完整的CDR1c DNA序列;其编码的蛋白序列经比对发现与其它念珠菌的Cdr1蛋白高度同源。结论利用简并PCR联合RACE方法能够有效、准确地克隆出希木龙念珠菌CDR1基因。

摘要：目的预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位。方法以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列。使用HLA-A*0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL。流式细胞仪技术检测DC表面MHC II类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟。ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ。四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性。结果根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位。流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA II类抗原,CD80,CD86和CD11c。Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性。ELISPOT实验结果表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ。结论本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考。

摘要：目的克隆孢子丝菌未知过氧化氢酶基因,命名为Sscat基因。方法根据生物信息库中7种已知真菌过氧化氢酶氨基酸序列的高度保守区域设计简并引物,PCR扩增获得部分Sscat基因cDNA片段,随后应用RACE技术分别扩增其3'端和5'端未知序列。结果 Sscat基因cDNA序列全长1 746 bp,其中包括5'端121 bp的非编码区、1 500 bp的编码区和109 bp的3'端非编码区。该基因编码499个氨基酸,分子量为56.07 kDa,其氨基酸序列与其他真菌过氧化氢酶氨基酸高度同源,其中与米曲霉、黑曲霉同源性分别为66.3%和56.6%,Sscat基因为申克孢子丝菌过氧化氢酶cDNA。结论简并PCR结合RACE技术成功克隆了孢子丝菌未知过氧化氢酶基因。

摘要：为探讨希木龙假丝酵母(假丝酵母又称念珠菌)的耐药机制,首先克隆出两株希木龙念珠菌ERG11基因,初步验证其功能,从而为后续研究奠定基础。从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)基因数据库中获取白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌Erg11蛋白的保守序列,设计简并引物,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得希木龙念珠菌ERG11cDNA部分片段;用快速cDNA末端扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)分别扩增其5′和3′端,获得完整的ERG11编码序列(coding sequence,CDS);将CDS克隆到pYES2表达载体中,在尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母中过表达ERG11;用微量液基稀释法检测转化后的酿酒酵母对氟康唑的敏感性,初步验证其功能。结果显示,简并PCR扩增获得预期708bp片段,5′RACE和3′RACE分别获得385bp和1 336bp片段,经纯化、克隆、测序、比对分析,获得两株菌的ERG11CDS;比对其编码的蛋白,与其他念珠菌的Erg11蛋白高度同源;分别检测克隆了这两株希木龙念珠菌ERG11CDS表达载体的酿酒酵母对氟康唑的敏感性,发现过表达ERG11明显降低其对氟康唑的敏感性。结果提示,简并PCR联合RACE能准确有效地克隆出希木龙念珠菌ERG11基因,用pYES2酿酒酵母表达系统能初步验证其功能。

摘要：目的：建立马尔尼菲青霉病血清实时荧光定量PCR诊断方法,对马尔尼菲青霉DNA行绝对定量.方法：针对马尔尼菲青霉内转录间隔区设计特异引物和Taqman探针,对马尔尼菲青霉、16种常见致病真菌、2种常见致病细菌和人基因组DNA行实时荧光定量PCR扩增,检测其特异性;以10倍浓度梯度的重组质粒为标准品,检测其敏感性.结果：该PCR方法特异度达100％;该方法最低检测限介于5～10 copies之间.结论：实时荧光定量PCR方法有助于早期、特异地诊断马尔尼菲青霉病.