摘要：聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)因灵敏度高、操作简便在各个领域得到了广泛的应用。然而,伴随其高灵敏度存在的非特异性问题在一定程度上限制了其应用。不同于普通检测方法,该技术的非特异性问题主要由可以指数扩增的引物二聚体(primer dimer,PD)引起。对此,引物设计时使用的中部同序引物对可以从根本上避免PD的产生,从而解决由其引起的非特异性问题。该文从PCR的发展和本质、PCR非特异性产生的原因和应对策略等方面作一总结及分析。

摘要：目的在内标双重PCR系统中寻找影响靶模板检测灵敏度的主要因素,并比较不同检测体系的灵敏度。方法针对HBV基因设计普通引物对和中部同序引物对,比较引物二聚体（PD）含量;控制内标基因的Ct值约为30,调整内标引物浓度为10、8、5、2、1μmol/L,比较不同体系的检测灵敏度;控制内标引物的用量不变,分别测定内标基因Ct值在15、20、25、30时的靶模板检测灵敏度。结果中部同序引物PD的Ct值在35以上,普通引物对PD的Ct值在30~33之间;10、8、5、2、1μmol/L浓度的内标引物需要内标模板的浓度分别为5×10^4、5×10^4、5×10^4、5×10^5、5×10^7IU/m L;不同内标引物用量检测灵敏度均为5×10^3IU/m L,仅使用中部同序引物的单重PCR检测灵敏度为5×10^2IU/m L;内标Ct值在15、20、25、30时靶模板检测的灵敏度分别为5×10^5、5×10^4、5×10^3、5×10^3IU/m L。结论在双重PCR检测体系中,对靶模板检测灵敏度影响最大的因素为内标的模板量,仅使用中部同序引物对的单重PCR具有最高的灵敏度。

摘要：目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25～30 mer探针加长到30～38 mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100 fg DNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。