摘要：目的设计和评价微测序基因芯片检测结核分枝杆菌(MTB)耐药性的价值。方法于北京结核病临床数据和样本资源库选取MTB实验室标准菌株(H37Rv)和109株MTB临床分离株,采用绝对浓度法进行表型药物敏感性试验(简称“表型药敏试验”)和基因测序法检测MTB耐药相关基因突变(包括inhA、katG、rpsL、gyrA、rrs、eis、rpoB和embB基因)。以荧光标记探针为基本检测原理设计制备微测序基因芯片,检测109株MTB临床分离株耐药基因突变,分析微测序基因芯片的检测效能。结果通过表型药敏试验及基因测序检测,明确了109株MTB临床分离株耐药相关基因(inhA、katG、rpsL、***、eis、rpoB和embB基因)突变位点及突变形式。微测序耐药检测基因芯片初期设计包含了katG、inhA、rpoB、gyrA、embB、rpsL、rrs和eis基因的目前已报道的所有突变位点的全部已知突变形式,共计220条探针,并确认出67条优秀探针。采用包含67条探针的微测序耐药检测基因芯片对109株MTB临床分离株进行检测。结果发现,与测序结果相比,除检测embB基因突变的2条探针外,其余65条探针检测碱基突变形式的符合率均超过95%,其中42条探针检测的符合率达到100.00%。以测序结果为参照标准,基因芯片检测对embB基因、gyrA基因、inhA基因、katG基因、rpoB基因、rpsL基因、eis基因和rrs基因突变检测的敏感度分别为64.21%(61/95)、80.00%(8/10)、95.83%(23/24)、98.55%(68/69)、92.63%(88/95)、93.85%(61/65)、75.00%(3/4)和94.44%(17/18);特异度分别为92.86%(13/14)、100.00%(99/99)、97.65%(83/85)、87.50%(35/40)、85.71%(12/14)、63.64%(28/44).100.00%(105/105)和98.90%(90/91);Kappa值分别为0.29、0.88、0.92、0.88、0.68、0.60、0.85、0.93。结论本研究研发设计了一套包含67条探针微测序耐药基因检测芯片,经过初步验证后证明其检测MTB耐药相关基因突变的效能较好,对embB基因的耐药检测探针还需进一步优化,使之更好的满足临床需求。

摘要：目的对化疗联合经皮超声电导抗结核药物治疗早期膝关节结核的疗效进行评价。方法搜集2010年1月至2015年7月首都医科大学附属北京胸科医院门诊及住院治疗的膝关节结核患者64例，采用前瞻性队列研究设计，按照抽签随机对照原则：化疗联合经皮超声电导抗结核药物治疗组（简称“联合治疗组”）29例，其中男16例，女13例，年龄18～61岁，平均（37．15±13．39）岁；单纯口服抗结核药物化疗组（简称“单纯化疗组”）。35例，其中男20例，女15例，年龄17～65岁，平均（36．45±12．30）岁。患者在治疗前后分别进行CT及MRI检查，以了解关节结核的病变治疗情况；以及比较患者治疗前后的美国特种外科医院膝关节评分（hospital for special surgery knee sore，简称“HSS评分”）结果。对上述两组的年龄、患病月数、治疗前后的HSS评分进行t检验，性别采用四格表检验，有效率采用秩和检验，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果两组在治疗前的性别（X2=0．238，P=0．722）、年龄（t=0．352，P=0．637）、患病月数（t=0．486，P=0．138）及联合治疗组患者治疗前的HSS评分为（73．53±6．70）分，单纯化疗组为（61．37±10．35）分（t=0．859，P=0．768），差异均无统计学意义。而治疗后联合治疗组的有效率为79．3％（23／29），优于单纯化疗组的68．6％（24／35）（Z=87．32，P=0．037）。联合治疗组患者HSS评分治疗后的（73．53±6．70）分，而单纯化疗组为（61．37±10．35）分（t=2．397，P=0．020），联合治疗组的治疗效果优于单纯化疗组。结论联合治疗组较单纯化疗组治疗效果好，值得推广应用。

摘要：目的探索肺结核患者的耐药状况及相关影响因素，为今后结核病防治工作提供参考依据。方法采用统一设计的调查问卷对2008年10月至2010年12月期间在上海市、广东省、天津市、河北省、河南省、重庆市、广西壮族自治区及云南省等8个省（直辖市、自治区）共49个实施单位的1992例痰培养阳性肺结核病患者进行调查，运用卡方检验比较敏感和耐药患者在人口学特征、痰结核分枝杆菌检验结果、治疗转归等方面的差异，检验水准为0．05；运用多因素logistic回归分析筛选耐药肺结核发生的影响因素。结果痰培养阳性的肺结核患者耐药率为19．2％（383／1992）。在对耐药肺结核患者进行单因素分析的基础上进行多因素非条件logistic分析，结果表明复治及治疗2个月末培养阳性结核病患者是发生耐药结核病的危险因素，β值分别为0．593、0．786，Sj值分别为0．172、0．191，Wald X2值分别为11．323、17．102，OR值（95％CI值）分别为1．789（1．312--2．398）和2．098（1．372-3．065），P值均〈0．001。结论复治及治疗2个月末培养阳性是痰培养阳性肺结核患者产生耐药的危险因素。

摘要：WHO在2014年《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》中在《耐药结核病规划管理指南（2006版）》、《耐药结核病规划管理指南紧急版》和《耐药结核病规划管理指南2011更新版》的基础上对抗结核药物分组进行了更新、补充和完善；这种分组法对耐药结核病化学治疗方案的设计十分有用。笔者对抗结核药物分组及其作用等进行解读。

摘要：目的研究北京市通州区结核病患者发病部位的关联性，为临床医师提供有关结核病患者的相关信息，为临床诊断和治疗决策提供帮助。方法以北京市通州区2006～2015年在首都医科大学附属北京胸科医院所有住院的638例结核病患者为研究对象，采用回顾性调查方法，查阅患者的住院病历信息，设计统一的调查表，内容包括结核病住院患者的性别、年龄、结核患病部位等信息，对患者的相关信息进行录入、整理。应用关联分析中的Apriori法研究结核病患者发病部位的关联性。结果638例结核病患者中共患39种不同发病部位的结核，涉及病变部位863处。同时患2个部位及以上结核病变的患者例数占总例数的27．6％（176／638）。863处病变部位中，主要包括肺结核459处（53．2％），结核性胸膜炎145处（16．8％），腰椎结核46处（5．3％），淋巴结结核34处（3．9％），支气管结核25处（2．9％），胸椎结核21处（2．4％）等。依据置信度〉10％建立关联，发现14条关联。结论某区1/4的结核病患者同时患有2个部位及以上的结核病变，因此，在诊断1个发病部位结核病变的时候要考虑到其关联的其他部位发生结核的可能。

摘要：目的基于SYBR Green I荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium ***)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插人序列ISI311为检测靶标设计引物,在60 C的退火温度下,建立鉴定MA的SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA.检测限为5.6x 102 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列ISI311为基础建立的SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。

摘要：目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^(TM)19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-lcrRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-lcrRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10^(1)拷贝/μl的质粒和10^(0)拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10^(6)拷贝/μl的MTE DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

摘要：目的建立结核分枝杆菌耐药相关基因多重PCR反应体系，评估该体系以临床分离株DNA和痰菌DNA为模板扩增耐药相关基因的成功率。方法常规提取结核分枝杆菌临床分离株（47株）及涂阳肺结核患者（21例）痰菌DNA。根据目前研究已发现的结核分枝杆菌耐药相关基因合成引物，建立2个多重PCR体系以扩增目的基因。扩增片段经测序证实后，计算该体系用于两种样本的扩增成功率。结果针对临床常用8种抗结核药物，选取结核分枝杆菌中rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、Ⅲ、P担共8个耐药相关基因设计合成引物。建立2个多重PCR体系扩增8个耐药基因，该体系扩增47株结核分枝杆菌l临床分离株DNA和21例菌阳肺结核患者痰菌DNA的成功率分别为100．0％（47／47）和76．2％（16／21）。结论本研究建立了高效扩增8个结核分枝杆菌耐药基因的多重PCR体系，结果对进一步研发结核病耐药分子诊断产品具有重要意义。

摘要：目的研究原核类泛素（Pup）-蛋白酶体系统对分枝杆菌生长活力的影响。方法分别敲除耻垢分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统中pup和蛋白酶体β亚基基因（prcβ）。选取待敲除基因的上下游侧翼序列设计引物，构建自杀性载体，靶基因同源序列和菌株基因组发生同源重组后获得基因敲除的菌株。分别连续测定野生型和基因敲除株在正常及低氧和厌氧应激培养条件下的吸光度值，比较菌株生长活力的变化。结果正确构建敲除pup和prcB基因的突变株，分别命名为△SM-Pup和△SM—prcB。△SM-Pup菌株生长速度快于野生型菌株和△SM-prcB株。prcB基因的敲除对细菌的生长活力没有产生明显的影响。结论Pup-蛋白酶体系统对耻垢分枝杆菌的生长产生了一定作用，但具体机制仍需要进一步研究探讨。

摘要：目的建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测体系，并用于不同类型临床样本的检测。方法常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA，9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA，12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA。设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针，建立ddPCR检测体系。应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数，进行统计学分析。结果建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系，该体系检测2个靶标的线性范围分别为0．5～8733和0．2～2893拷贝／μl反应体系。该体系具有较好的重复性（r〉0．95），以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％。在痰和血浆DNA样本检测中，2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组。结论结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系，可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测，对提高结核病病原学诊断能力有重要意义。