摘要：全球公共卫生领域的重大威胁之一的感染性疾病,是指主要由病原微生物引发所导致的疾病的统称。传统的病原学检测方法如体外高通量测序技术、质谱法、形态学、免疫相关的抗原抗体检测,以及经典的分离培养与鉴定,仍然是诊断感染性疾病广泛应用的重要手段,但已无法满足临床对快速精准诊断和高效对症治疗的需求。病原靶向高通量测序技术(tNGS)针对特定病原微生物的基因序列设计特异性引物,利用超多重PCR建库体系对目标序列进行靶向正向扩增和富集,之后进行靶向高通量测序。与常规感染性疾病检测技术相比,tNGS的创新之处在于实现了广谱精准的病原检测。当前,国内外的研究主要聚焦于tNGS在呼吸道感染病原体诊断方面的应用。然而,tNGS的潜力并不仅限于此,它同样可以被有效地应用于其他类型的系统性感染,例如中枢神经系统感染等。本文综述了近年来国内外关于tNGS在感染性疾病精准诊断应用的进展,以及其在检测效能、优势和局限性方面的讨论,以确保tNGS在临床疾病诊断中能够得到合理应用。One of the significant global public health threats is infectious diseases, which are essentially disorders mainly triggered by pathogenic microorganisms. Traditional pathogen detection approaches, such as high-throughput sequencing techniques, mass spectrometry, morphology, antigen-antibody detection, and the classic isolation and identification, remain crucial means for diagnosing infectious diseases. Nevertheless, they fail to fulfill the clinical requirements for rapid, precise diagnosis and efficient targeted treatment. The principle of targeted next-generation sequencing (tNGS) for infectious diseases involves combining multiple polymerase chain reaction (PCR) with second-generation sequencing technology. This technology targets specific gene sequences of pathogenic microorganisms by designing specific primers and utilizes a multi-target PCR library construction system to carry out targeted forward amplification and enrichment of the target sequences. In comparison with conventional infectious disease detection technologies, the novelty of tNGS lies in achieving extensive and precise pathogen detection. Currently, research both domestically and internationally is primarily concentrated on the application of tNGS in the diagnosis of respiratory infection pathogens. However, the potential of tNGS is not restricted to this;it can also be effectively applied to other types of systemic infections, like central nervous system infections. This review summarizes the recent advancements of tNGS in the precise diagnosis of infectious diseases at home

摘要：信息时代的高度发展,为教学提供了网络教学的便利条件,同时也为医学检验专业学生的培养方案提出了新的要求,综合网络平台教学与传统课堂的优缺点,我们提出医学检验专业网络平台与传统课堂有机整合模式,探讨了该模式下的教学设计与教学策略,并总结了网络平台与传统课堂有机整合模式的特征,该模式的应用为人工智能时代医学检验专业学生的培养提供理论与实践依据。

摘要：人参和西洋参作为我国常用名贵中药,其价值很高,由于它们为人参属近缘物种,因此二者在形态和化学成分方面较为相似。然而人参和西洋参的药性和药效有较大区别,二者在临床上不可混用,所以对二者进行鉴定就尤为重要。该研究基于人参与西洋参基因组DNA上的特异性snp位点,设计了5′端含有G-四链体互补序列的上下游引物,通过PCR扩增出大量含G-四链体的双链DNA,与氯高铁血红素(Hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的DNA酶(DNAzyme),并在H_(2)O_(2)存在的情况下催化ABTS发生颜色变化。通过对PCR体系以及显色体系的优化,达到快速、简便地鉴别人参与西洋参,灵敏度可达到0.1 ng/μL。研究建立了针对人参和西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法,为人参与西洋参的鉴别提供了新的途径。

摘要：采用多重PCR方法建立一种快速准确鉴别人参、三七和西洋参的检测体系,并将其用于市售样品的检测。利用筛选的人参、三七和西洋参特异的单核苷酸多态性位点设计引物,在引物3′末端进行锁核酸修饰和碱基错配以封闭末端,增强引物特异性。建立多重PCR检测体系,并对反应条件进行优化。对市售样品进行验证。建立的多重PCR检测体系,人参、三七和西洋参特异性条带分别为249、366、212 bp。在59℃的退火温度,35个循环,40 ng的DNA,人参、三七、西洋参引物量体积比为0.15μL∶1.25μL∶0.3μL的反应条件最佳。对于不同参类产品进行检测,结果表明,粗加工产品的阳性率高于深加工产品。选取市场上不同来源的粗加工产品进行多重PCR检测阳性率达到80%以上。多重PCR检测体系灵敏度高,重复性好,可用于市售样品的检测。

摘要：目的本研究旨在研制一种快速检测试剂盒,鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,并对其进行性能评价。方法建立DNA提取方法,确保有效提取桃仁及苦杏仁基因组DNA,紫外分光光度法测其浓度及纯度。美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询并比对桃仁及苦杏仁的ITS序列,针对特异性位点,NCBI Primer-Blast设计种属特异性引物。建立并优化聚合酶链式反应(PCR)检测体系,DH5α感受态细胞克隆特异性片段,测序验证体系准确性,制备阳性对照。组装DNA检测试剂盒,对其特异性、稳定性及重复性进行评价,并对市售桃仁和苦杏仁样品进行检测。结果所建立DNA提取方法,提取效率高,DNA质量浓度高于100 ng·μL^(-1),A_(260/280)处于1.80~2.10之间。该试剂盒可准确鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,检测灵敏度高,特异性强,最低检测限为1 ng·μL^(-1)。反复冻融20次后仍可有效检测,可于-20℃保存1年。20个市售样品中检出1个桃仁伪品及2个苦杏仁伪品,其余均为正品。结论桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒特异性强、灵敏性高、稳定性好,具有良好重复性,可快速鉴定桃仁及苦杏仁,为桃仁中药材市场质量安全管理提供有力支持。

摘要：目的基于PCR-核酸试纸条技术,建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA,以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物,经克隆转入大肠杆菌感受态细胞DH5α,鉴定PCR产物;分别在引物的5’端标记FITC与Biotin;组装核酸试纸条,建立PCR-核酸试纸条的方法;优化反应体系中胶体金标记的链霉亲和素与抗体浓度的最佳工作量;并对试纸条进行反应原理验证及灵敏度、特异性、稳定性评价;对某生物科技有限公司制药用水检测出的7株皮氏罗尔斯顿菌进行实验并利用MEGA构建进化树,对污染溯源进行分析。结果煮沸法提取基因组浓度较好,纯度1.8~2.0;PCR产物经克隆转化、测序比对,与GenBank已登记的皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA相似度为100%;利用胶体金放大原理,每100μL胶体金溶液中,加入3.5μL链霉亲和素进行标记,硝酸纤维素膜上检测线为2.0 mg/mL抗FITC抗体,质控线为1.2 mg/mL生物素化BSA,与阳性扩增产物结合产生红色条带;按照优化条件进行试纸条组装,每100μL样品展开液中加入8μL PCR产物,反应5 min后观察结果;核酸试纸条特异性结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致,仅有皮氏罗尔斯顿菌为阳性结果,不动杆菌、气单胞菌、假单胞菌、非脱羧勒克氏菌均为阴性结果;核酸试纸条灵敏度评价,将DNA浓度降至10-5ng/μL时,试纸条检测线仍有条带,较琼脂糖凝胶电泳结果灵敏度高1000倍;核酸试纸条稳定性评价,将试纸条在3、6、9、12月进行检测,稳定性较好。结论建立PCR-核酸试纸条技术检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌,具有简单快速、特异性强、灵敏度高、成本较低等优点,适用于制药企业对制药用水的日常检测。

摘要：目的:建立中药材三斑海马DNA指纹鉴定方法,研制三斑海马DNA检测试剂盒。方法:利用生物信息学对海马种属的Cytb基因进行分析,以该基因作为靶基因,设计特异性引物,研制三斑海马DNA提取及PCR快速检测试剂,应用分子克隆及测序技术,克隆三斑海马阳性对照药材,并对快速检测试剂盒的特异性、稳定性、重复性及灵敏度进行考察,对市售三斑海马样品进行真伪鉴定。结果:基于Cytb序列可对三斑海马及其混伪品进行区分。自主研发的三斑海马快速检测试剂提取的海马DNA纯度和浓度均可达到PCR的要求,在退火温度为61.5℃时引物特异性最强;克隆测序后三斑海马DNA序列与海马mtDNA Cytb特异指纹区段序列一致;自主研制的试剂重现性、稳定性良好,检测浓度最低限为10^(-3)ng·μL^(-1);对17个市售样品进行检测,合格率为88.2%。结论:建立了一种特异、准确的检测中药材三斑海马DNA指纹鉴定方法;研制的三斑海马DNA检测试剂盒操作简便,灵敏度高,检测结果稳定。

摘要：目的:构建高活性、低毒性的新型杂合肽,对其抗肺炎克雷伯菌活性进行评价,探讨其在防治肺炎克雷伯菌引起的呼吸道感染的潜在应用价值。方法:通过生物信息学软件分析亲本肽dyskinbow-1ST的理化性质,预测杂合肽活性区域,确定与天蚕素Cecropin A的构建策略;应用生物信息学软件分预测杂合肽的理化性质及抑菌活性;通过固相法合成杂合肽DY-CA,用杂合肽对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)试验,杂合肽对肺炎克雷伯菌的时间生长曲线,羊血红细胞溶血试验,分析DY-CA的抑菌活性及生物相容性;通过结晶紫染色定量法观察生物膜的改变,研究杂合肽对肺炎克雷伯菌生物膜的抑制与清除效率。结果:经在线软件预测分析,杂合肽DY-CA为稳定的带正电荷疏水性抗菌肽,试验测得杂合肽的MIC为64μg·mL^(-1);对肺炎克雷伯菌的抑菌作用具有时间和浓度依赖性,杂合肽在3 h后表现出明显的抑制作用,2MIC、1MIC的杂合肽A基本上没有变化,肺炎克雷伯菌的生长完全被抑制;在有效浓度下,羊血红细胞溶血率为4.23%(<5%)为阴性;0.5MIC(t_(0.5MIC)=11.10,P<0.05)、1MIC(t_(1MIC)=17.96,P<0.05)、2MIC(t_(2MIC)=14.18,P<0.05)的杂合肽DY-CA均可抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成;0.5MIC(t_(0.5MIC)=11.10,P<0.05)的杂合肽DY-CA对肺炎克雷伯菌成熟生物膜清除效果不明显,1MIC(t_(1MIC)=17.96,P<0.05,)、2MIC(t_(2MIC)=14.18,P<0.05)的杂合肽DY-CA可显著破坏肺炎克雷伯菌成熟生物膜。结论:本试验设计构建并筛选了具有高活性、低毒性的新型杂合肽DY-CA,对肺炎克雷伯菌具有高效、快速的抑菌作用,有望成为防治肺炎克雷伯菌引起的呼吸道疾病的新型药物。

摘要：目的:建立1种双重PCR检测体系,根据琼脂糖凝胶电泳目的条带位置及数量快速鉴定花鹿茸、马鹿茸及常见伪品驯鹿茸。方法:采用碱变性法提取鹿茸样品基因组DNA,以鹿科动物Cytb和COI基因为靶序列,应用Primer 3.0,根据SNP位点设计特异性鉴别引物(Cy-1、COI-1),并摸索及优化PCR反应体系及条件,同时,采用克隆及测序验证检测结果的准确性。结果:建立的双重PCR扩增体系显示,花鹿茸在电泳图谱408 bp及146 bp处可见2条扩增条带,马鹿茸则在146 bp处见1条目的条带,而伪品鹿茸则无扩增条带,与质粒克隆测序验证的结果一致。且市售鹿茸样品的检测结果与鉴定结果相吻合。结论:本试验自主构建的双重PCR检测体系简便、迅速,检测试剂结果准确,稳定性良好,在分子水平实现一步法鉴定花鹿茸、马鹿茸及其常见伪品,具有较大实用价值。

摘要：目的:靶向沉默人乳腺癌细胞Survivin与雌激素受体-α(ER-α)36双基因的表达,探讨其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响。方法:采用生物信息学技术设计并构建RNAi片段(siRNA-ER-α36),转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株。采用噻唑蓝染色法检测细胞增殖情况。采用RT-PCR、Western blot方法检测细胞中Survivin、ER-α36与凋亡蛋白Caspase-3的mRNA及蛋白表达情况;流式细胞术检测转染细胞凋亡率。结果:RNAi片段成功转染MDA-MB-231细胞,24 h转染率的平均值为68%,48 h转染效率可达76%(P<0.01)。与空白对照组比较,RNAi片段转染后MDA-MB-231细胞Survivin和ER-α36基因的mRNA和蛋白含量明显下降(P<0.05),而上调Caspase-3凋亡蛋白的表达;MDA-MB-231细胞增殖能力降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05)。结论:RNAi靶向沉默并下调Survivin与ER-α36基因的表达,上调Caspase-3凋亡蛋白的表达,从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,促进细胞凋亡,提示RNAi沉默可成为对乳腺癌相关基因功能研究的主要技术之一。