摘要：目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtdna Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。

摘要：目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组dna,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^(-1)。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。

摘要：目的构建一种能够可视化快速鉴定中药全蝎及其伪混品的方法。方法应用改良十二烷基硫酸钠碱变性(SDS)法提取基因组dna。选取细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列设计全蝎特异性引物,进行标记。优化聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系,克隆制备全蝎阳性质控品作为对照。构建PCR产物检测试纸条,鉴定市售样品的真伪。结果只有正品中药全蝎在286 bp处扩增出特异性条带,且试纸条的检测结果为阳性,检测灵敏度达到1.0×10^(-2)ng·μL^(-1)。20个全蝎市售样品中18个正品样品,2个不合格样品。结论建立的中药全蝎可视化试纸条检测的方法特异、灵敏、稳定、简单、快速,为中药全蝎的真伪鉴定提供了安全可行的方法。

摘要：目的研发鹿胎dna阳性质控品,组装检测试剂盒。方法提取鹿胎及其伪品dna,设计通用鹿引物并进行PCR扩增,克隆种属特异性目的片段,构建鹿胎dna阳性质控品并组装dna检测试剂盒,进行试剂盒性能实验并应用于市售鹿胎样品检测。结果应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)分析测序比对结果,正确率为100%,在526 bp处可见明显条带,与目的片段相符,可作为鹿胎阳性质控品。阳性质控品灵敏性最低检测限为10 ng·μL-1,经多次反复冻融的试剂盒,仍可确保PCR检测结果的稳定性。试剂盒应用于对市售鹿胎及伪品的检测,PCR检测结果与预期相符。结论构建鹿胎阳性质控品作为电泳分析时的阳性对照,结果更加准确稳定,适用于对鹿胎及伪品的快速鉴定,保障对鹿胎质量的有效监管。

摘要：目的:建立针对真菌类中药材茯苓的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定技术,从分子生物学角度出发,对茯苓的真伪进行鉴定。方法:对经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行改良,提取样品基因组dna,以茯苓内转录间隔区(internal transcribed space, ITS)为目的序列,设计特异性引物,优化PCR反应体系,建立茯苓PCR鉴定方法,同时克隆特异性扩增的目的条带,测序鉴定其准确性,最后进行方法学验证。结果:提取的基因组dna浓度较高、纯度较好、完整度良好。琼脂糖凝胶电泳结果表明正品茯苓可以在199 bp处出现单一明亮的特异性扩增条带,而伪品不出现扩增条带,引物的特异性为100%,克隆后的目的片段电泳图谱清晰明亮,克隆片段与Genbank数据库中已登记的茯苓物种序列相似性高达100%。在操作人员不知样品真伪的情况对样本检测,目标条带出现位置与预期一致;灵敏度检测结果表明,dna检测下限可达1 ng·μL^(-1);挑选3位实验室人员进行茯苓真伪检测,结果相同且和预期一致,建立的茯苓PCR鉴定方法特异性良好,准确性高,重复性好。结论:PCR鉴定技术为茯苓的真伪鉴别提供了简便可靠、特异性良好,并且准确性高的鉴别方法。采用分子克隆技术可以成功保存茯苓标准对照品,测序结果准确可靠。

摘要：目的建立一种将dna提取技术与PCR技术相结合的天麻dna真伪鉴定试剂盒,并对试剂盒性能进行方法学评价。方法通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查找天麻及其常见伪品紫茉莉根、大丽菊块茎、马铃薯的ITS2序列,应用dnaMAN进行多序列比对,NCBI-Primer-Blast设计天麻特异性引物。改良植物常用dna提取的CTAB法,确保提取出高效的正品天麻及其常见伪品的基因组dna,应用紫外分光光度法测其浓度及纯度。优化PCR反应体系,确定试剂盒的组成与反应条件,随机抽样检测市售天麻样品。结果应用所研制的试剂盒提取样品dna,纯度OD260/OD280值为(1.87±0.13),灵敏度为10 ng·μL^(-1),3次重复性检测结果相同,反复冻融5、10、15、20次对检测效果无影响,于-20℃可保存1年,检测10个市售天麻样品,其中7个是正品,3个是伪品。结论道地药材天麻dna真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性均良好,检测结果准确,适用于天麻及其常见伪品的快速鉴别。

摘要：目的:构建哈蟆油药材真伪可视化鉴定的方法,尝试解决哈蟆油药材的鉴别难题。方法:根据改良SDS法,提取哈蟆油dna。根据GenBank下载中国林蛙基因序列,设计并筛选出特异性最佳的引物;构建蛙类通用引物与特异性引物的PCR双重体系;利用荧光素及生物素标记特异性引物,评价试纸条可视化检测核酸产物的可行性。结果:成功设计并筛选出哈蟆油特异性引物,构建了双重PCR体系。利用标记成功的特异性引物成功构建了核酸产物可视化试纸条,在10 min左右可观察检测结果。通过大量实验样本验证了该种方法的特异性及稳定性。结论:该研究利用核酸产物试纸条进行哈蟆油药材的真伪鉴定,为哈蟆油的快速鉴定提供新的思路和新的方法,同时也具有较高的推广和应用价值。

摘要：本研究针对平贝母的ITS2序列设计特异性鉴别引物,优化反应体系及条件,构建PCR-核酸试纸条实现可视化检测平贝母。通过分子克隆及测序技术,构建平贝母dna阳性对照品,制定质量标准。对建立的方法进行性能评价,检测其灵敏度、特异性和重复性,对市售样品进行真伪鉴定。结果显示,基于ITS2序列可对平贝母及其混伪品进行区分。正品平贝母PCR产物滴定于试纸条上显示T、C线两条带,伪品与阴性对照只显示C线一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合。特异性为100%,PCR-核酸试纸条灵敏度可达0.1 ng·μL^(-1),高于凝胶电泳检测10倍。16个平贝母市售样品中11个合格,5个不合格。综上,本研究建立的平贝母PCR-核酸试纸条检测方法特异、快速、精准、可视化,可为平贝母检测提供新的技术思路。

摘要：目的:基于酶促恒温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术建立一种可快速定性鉴别道地药材天麻真伪的方法。方法:遵循ERA引物设计原则,应用Oligo 7.0软件根据天麻及其常见伪品的ITS2基因组序列,筛选优化天麻ERA特异性引物,应用Primer Premier 5.0软件设计天麻特异性PCR鉴别引物,通过对ERA、PCR反应体系的优化,最终确定ERA最佳反应时间为17 min,最适反应温度为40℃;PCR最优退火温度为57℃,循环为32次,对所建立的方法进行灵敏度、特异性验证,并选取中药市场市售天麻样品进行检测。结果:所设计的天麻ERA鉴别引物与其常见伪品间无交叉反应,特异性良好;重复性结果显示,3次重复性检测结果一致,未出现假阳性与假阴性;该方法对天麻基因组dna的灵敏度为1 pg·μL^(-1),比传统PCR灵敏性高;ERA技术能够用于天麻市售样品的快速鉴定,且检测结果与PCR方法相同。结论:所建立的检测方法操作简单、快速,具有较高的特异性和灵敏度,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了一种新手段。

摘要：本研究旨在研制一种快速鉴定肉制品中狗源性成份的dna检测试剂盒,并对此试剂盒做出方法学评价。以改良SDS-PK法提取狗肉及掺假肉品种(狐肉、貂肉)基因组dna,选择具有种属特异性的线粒体细胞色素B基因作为鉴定靶基因,应用Primer5.0设计特异性引物,建立狗源性dna检测方法,组装狗源性dna检测试剂盒,并进行特异性、稳定性及重复性评价。结果表明,本试剂盒可有效检测肉制品中狗、狐、貂源性成分,dna提取效率高,仅0.05 g肉样即可提取浓度高于100 ng/μL的基因组dna,OD260/280处于1.80~2.00之间,最低检测限为10-4 ng/μL,所有检测步骤可在4.5 h内完成,操作简便,特异性高。试剂盒所采用试剂安全无毒,反复冻融20次后仍然有效,可于-20℃保存一年。随机抽取12份市售样品进行检测,有3份样本中存在狐、貂肉冒充狗肉现象,掺假率高达25%,该结果与长春食品药品检验中心检测结果一致。狗源性dna检测试剂盒灵敏性高、特异性强,检测结果准确稳定,具有良好重复性,适用于狗肉快速定性检测。