摘要：目的:应用shRNA技术,构建P2Y6基因稳定干扰的乳腺癌细胞株,为P2Y6调控乳腺癌发生发展的功能及机制研究奠定基础。方法:以人P2Y6基因为靶序列,设计并合成干扰序列,并将其插入经EcoR I和Age I酶切的PLKO线性化质粒。阳性克隆经EcoRⅠ和NdeⅠ酶切、测序正确后与ps-PAX2、pMD2.G和PLKO重组慢病毒载体共转染293T细胞,包装成完整病毒。病毒经富集后感染乳腺癌细胞BT549,经嘌呤霉素筛选P2Y6稳定干扰的乳腺癌细胞。通过RT-PCR、Western blot等方法检测P2Y6的干扰效率。最后通过MTS实验对P2Y6基因稳定干扰后乳腺癌细胞的增殖能力进行评价。结果:阳性克隆经DNA测序后与预期相符。稳定转染P2Y6shRNA的BT549细胞中P2Y6的mRNA和蛋白表达水平与对照组细胞相比明显下降。P2Y6基因干扰后乳腺癌细胞的增殖能力没有显著变化。结论:成功构建人P2Y6基因表达稳定干扰的乳腺癌细胞株BT549。P2Y6的表达与乳腺癌细胞增殖无明显相关性。

摘要：目的探讨G蛋白偶联受体信号通路中各主要因素和癌症发生、发展、转移之间的关系,为临床癌症治疗靶标的确定提供启发。方法通过国内外诸多相关文献的调研,总结G蛋白偶联受体通路与癌症的关系,展望其在临床癌症治疗中的应用。结果经过大量的文献调研和展望,发现G蛋白偶联受体信号通路中G蛋白偶联受体(GPCRs)、G蛋白、受体酪氨酸激酶(RTK)、G蛋白信号途径调节蛋白(RGS)的突变、异常表达和失调都和癌症密切相关。结论很多的证据表明了G蛋白信号异常与癌症发生和发展之间有着密切关联,今后可以加大对此类靶点临床药物的设计。

摘要：目的:构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒并进行鉴定.方法:根据小鼠ATP4B启动子序列设计引物,获得的小鼠ATP4B基因启动子序列,并加入限制性内切酶酶切位点.将其装入载体IRES-GFP,获得重组载体ATP4B-IRES-GFP并进行酶切鉴定.之后将SV40T基因克隆入ATP4B-IRES-GFP载体,并用限制性内切酶PstI和AseⅠ进行验证.结果:将小鼠ATP4B启动子序列插入IRES-GFP载体,经过酶切验证获得正确的ATP4B-IRES-GFP质粒;将SV40T片段插入ATP4B-IRES-GFP,质粒测序及酶切结果验证获得正确的ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒.显微注射入小鼠受精卵可获得阳性小鼠.结论:成功构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒,可用于下一步构建原发性胃癌转基因小鼠.

摘要：目的构建大鼠Smad6基因的慢病毒干扰载体,并在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中验证其基因沉默效率。方法针对大鼠Smad6基因设计、合成两对Smad6-shRNA干扰序列,并将其重组到pLKO.1质粒载体中。测序验证后在HEK293T细胞内组装慢病毒。最后体外分离培养大鼠BMSC,通过慢病毒感染将Smad6干扰序列转导到细胞内,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)及Western蛋白印迹法检测其对Smad6基因的干扰效率。结果成功构建并包装2个大鼠Smad6基因干扰的慢病毒载体和慢病毒。与阴性对照组比较,重组慢病毒感染大鼠BMSC后经实时荧光定量PCR验证,2种重组病毒的干扰效率分别达到92.5%和93.4%,Western蛋白印迹法显示Smad6基因被干扰后蛋白表达明显下降。结论成功构建出可有效干扰大鼠Smad6基因的慢病毒载体,为进一步研究其功能及应用提供有效工具。

摘要：目的建立和评价一种适合国境口岸及基层检验部门使用的沙门氏菌快速检测方法,在2010年上海世博会保障期间开展应用研究。方法针对沙门氏菌agfA基因,运用环介导等温扩增技术(loop mediated isothermalamplification,LAMP),设计引物进行检测,在65℃恒温条件下、60 min特异性扩增,荧光显色观察结果。对建立的方法进行特异性、灵敏度试验及模拟样本灵敏度试验,与荧光定量PCR、胶体金方法进行比对。并对54株临床分离阳性样本加以验证。结果沙门氏菌属6种不同血清型菌株LAMP检测都呈阳性,其他4种肠道细菌均为阴性;LAMP法的灵敏度与RT-PCR方法接近,达103CFU/ml,是胶体金检测法的100～1 000倍;54株沙门氏菌临床分离样本实验符合率达到100%。结论 LAMP技术能够在简易的实验条件下快速报告结果,检测成本较低、特异性高、灵敏度高,适合口岸从业人员及基层检验部门进行沙门氏菌的初步筛查工作。

摘要：将HIV-1p24基因插入至人工设计的复合多表位基因MEG中,获得嵌合基因MEGp24;将MEGp24插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法筛选出重组病毒;将重组病毒大量制备并纯化后,分别于0,14,42天肌肉注射免疫BALB/c小鼠;第3次免疫后一周,采集小鼠全血与脾脏,分离血清并无菌制备脾淋巴细胞,ELISA法检测小鼠血清HIV-1抗体、脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-α和IL-2的含量,流式细胞仪测定CD4+,CD8+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,重组病毒刺激小鼠产生HIV-1特异性抗体,出现T细胞亚类数量增加,产生针对HIV-1 H-2d限制性CTL表位的特异性靶细胞杀伤作用,同时免疫小鼠脾细胞在HIV-1抗原肽的刺激下分泌Th1类细胞因子的水平大幅增加.研究提示多表位嵌合基因重组FPV疫苗具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.