摘要：旨在预测羊口疮病毒(ORFV)ORF125蛋白结构及其在真核表达质粒转染细胞中的定位。设计引物PCR扩增ORF125基因,并将其定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定后得到阳性重组表达质粒pEGFP—ORF125。利用DNAStar和MEGA4.0元件分析不同毒株间ORF125基因的遗传进化关系,接着通过在线Expasy工具预测其二级结构并与Bcl-2家族成员进行比较。利用脂质体介导法转染山羊皮肤成纤维细胞(GSFs),经DAPI染色后在激光共聚焦显微镜下观察ORF125的亚细胞定位。结果显示:本次克隆的ORFV ORF125基因与国外公布的其他羊口疮毒株核苷酸水平相似性为97.1%~98.1%,与同属另外2株羊伪牛痘病毒相比,核苷酸相似性分别为84.1%(GQ329669)和85.6%(GQ329670);蛋白二级结构预测分析发现ORF125与Bcl-2家族成员α-螺旋位置相近,预测空间结构有很大的相似性;激光共聚焦显微镜观察发现ORF125在GSFs细胞质中呈弥散性分布。结果提示,羊口疮病毒ORF125基因非常保守,预测与Bcl-2蛋白有着相似的功能,重组质粒pEGFP-ORF125构建成功,ORF125基因在GSFs中得到表达,定位于细胞质中。

摘要：RNAscope原位杂交是一种检测细胞内靶标RNA的新型检测技术,为验证该技术能否用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒2型(PRRSV-PCV2)的共感染,本研究针对PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列,分别设计两组特异性探针,利用RNAscope原位杂交技术分别检测了PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV-PCV2共感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)以及一例PRRSV-PCV2共感染猪的多个组织样品,同时采用间接免疫荧光试验(IFA)以及RNAscope原位杂交联合IFA对PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV-PCV2共感染的PAMs进行检测。结果显示,通过RNAscope原位杂交技术检测PRRSV N基因和PCV2 Rep基因检测到同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染;通过IFA检测PRRSV Nsp9蛋白和PCV2 Cap蛋白检测到同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染;两种方法联合使用结果显示,通过RNAscope探针检测PRRSV N基因和IFA方法检测PCV2 Cap蛋白,或者通过RNAscope探针检测PCV2 Rep基因同时用IFA方法检测PRRSV Nsp9蛋白来检测同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染。同时,RNAscope原位杂交技术能够在PRRSV-PCV2共感染猪的肺脏、脾脏和淋巴结的组织切片中检测到PRRSV和PCV2共感染的细胞。以上结果表明RNAscope原位杂交技术适用于PRRSV-PCV2共感染的细胞和组织样品的检测,为研究PRRSV-PCV2共感染及协同致病机制奠定了基础。

摘要：美育作为助人实现自由全面发展的有效途径受到了广泛重视,开展美育工作是高校占领意识形态高地、提高学生创新能力、全面实现生态文明、增强民族文化自信的迫切需要。作为“大美育观”的马克思主义美育观,是未来高校开展美育工作的重要理论指南。面对当前高校美育力量相对薄弱的问题,作者结合马克思主义美育观提出了抓好教育、强化实践、树立榜样、因地制宜、与时俱进五项措施,以期为改善高校美育工作提供一些参考。

摘要：为建立区分MG弱毒疫苗株F株和非F株以及滑液囊支原体的方法,试验通过分析NCBI上公布的MG和MS基因序列,优选合适的基因序列设计合成了MG弱毒疫苗株F株特异性引物、非F株MG通用引物、MG通用引物以及MS通用引物,各引物扩增条带大小分别为750、585、279和421bp,建立了可以区分MG弱毒疫苗株F株与非F株以及滑液囊支原体的PCR检测方法。结果显示:各引物的特异性或通用性良好,检测限度可以达到100fg/μL。研究表明,该试验建立的四重PCR检测方法可用于MG弱毒疫苗株F株与非F株的鉴别诊断以及滑液囊支原体的检测,为该病的净化提供技术支持。

摘要：为构建表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)致密颗粒蛋白10(dense granule protein 10,GRA10)N端(AA 4-478)的重组质粒并在大肠杆菌中表达纯化该重组蛋白,以用于后续的诊断检测试剂盒设计。根据GRA10的基因序列设计并合成特异性引物,通过PCR方法从弓形虫ME49虫株cDNA中扩增GRA10(AA 4-487)的编码片段,利用同源重组的方法将其连接到pE-SUMO载体上。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)后并用IPTG诱导SUMO-GRA10的表达,产物通过SDS-PAGE分析并用亲和层析方法纯化,然后采用Western blot分析其免疫反应性。结果表明,已成功构建了表达弓形虫GRA10蛋白的重组质粒并利用原核表达系统表达纯化了具有良好免疫反应性的蛋白,为弓形虫病诊断奠定了基础。

摘要：为快速同时检测牛星状病毒(BAstV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),本研究针对BAstV基因组ORF1a基因、BVDV基因组多聚蛋白基因和IBRV基因组g B基因的保守区域各设计特异性引物和探针,经反应体系和扩增程序优化,建立了BAstV、BVDV和IBRV三重荧光PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并应用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该方法可扩增BAstV、BVDV和IBRV的核酸,不能对多杀性巴氏杆菌(Pm)、B型牛鼻炎病毒(BRBV)、口蹄疫病毒(FMDV)等病原的核酸进行扩增,特异性较强;对BAstV、BVDV和IBRV的最低检测限(LOD)均为305copies/μL,敏感性较高;检测BAstV、BVDV和IBRV的组内、组间重复性试验变异系数(CV)值均小于3%,重复性较好。应用该方法检测100份临床样品,BAstV、BVDV、IBRV的阳性检出率分别为0、11%、6%。本研究建立的三重荧光PCR方法具有敏感性高、特异性强、在同一反应体系中可以快速鉴别检测BAstV、BVDV、IBRV等优点,可应用于临床BAstV、BVDV、IBRV感染的检测。

摘要：为了解山羊鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的流行情况,本研究针对ENTV-2的env基因设计了1对特异性引物与探针,通过RT-PCR条件优化,成功建立了ENTV-2荧光RT-qPCR检测方法。该方法特异性高、灵敏性强(5.61 copies/μL)、重复性好(CV为0.09%~1.20%)。本研究建立的一步法荧光RT-qPCR方法为ENTV-2的临床检测以及流行病学调查提供技术支撑。

摘要：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是猪的肠道传染病病原,主要引起仔猪呕吐、腹泻和脱水,对一周龄内的哺乳仔猪危害最为严重,死亡率可达50%～100%。利用Vero86细胞从湖北某猪场腹泻仔猪小肠病料中分离到一株病毒,经RT-PCR检测、序列比对后确定其为PEDV,命名为HB201503株。设计PEDV s1基因的全长扩增引物,获得该株病毒的s1基因全长序列并进行了进化分析,结果表明该毒株与近年来在Gen Bank登陆的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%～99.2%,与疫苗株CV777相似性较低,仅为91.8%。通过s1基因进化树分析表明HB201503以及近几年国内分离毒株主要集中在第I个亚群,且HB201503株与KM406183（2014,四川）和KM609206（2015,江苏）同源性较高。此外,s1蛋白氨基酸序列比对显示,HB201503与近几年分离毒株及疫苗株CV777均在55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸的缺失或替换,而且HB201503株与CV777及近几年分离毒株相比,还在270-283位氨基酸上出现了1个氨基酸的缺失和10个氨基酸的替换。

摘要：为预测并鉴定猪丹毒丝菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)分子线性B细胞表位,首先通过多序列比分析已经全基因组测序的10株菌株的GAPDH一级结构保守性;然后使用在线软件Bepipred-2.0预测猪丹毒丝菌GAPDH线性B细胞表位,接下来通过人工化学合方式合成GAPDH表位对应的多肽;最后使用间接ELISA法检测这些多肽与猪丹毒丝菌GAPDH高免血清之间的反应。研究发现已经完成全基因组测序的10株菌株的GAPDH一级结构高度保守。通过软件预测,找到了猪丹毒丝菌GAPDH的3个潜在的表位。ELISA检测结果表明74VLSERDPKNLPWKELGV90和178HAYTNDQNTLDGPHAKGDLRRGRAAAQSIIPNSTGA213与GAPDH高免血清反应明显,是猪丹毒丝菌GAPDH的表位。成功预测并鉴定到2个猪丹毒丝菌的抗原表位,这些表位将为以后基于猪丹毒丝菌GAPDH表位的诊断、疫苗设计及致病机制研究提供技术基础。

摘要：人畜粪污的全量化收集利用,对加强环境保护、减少人畜粪污乱排乱放,有效解决沼气池、化粪池清淘作业安全隐患,推动种养结合绿色发展模式和不断改良土壤肥力、提升农产品质量发挥重要作用。巴东县畜牧兽医服务中心联合湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,结合山区生猪养殖规模特点和作物种植的地势特点,设计出新型的阳光板粪污发酵池,阳光板发酵池采用半埋式,整体采用长度15 cm以上的空心砖砌筑,表面做抹灰处理,顶面中间采用可活动式的透明板材覆盖,根据田间地块自行决定长、宽、高,一般情况下的容积范围10~30 m3。阳光板发酵池周边设置围栏和警示牌,顶部透明板上锁。将阳光板发酵池因地制宜结合果园等开发出“山区阳光板发酵池+农田滴灌”的模式,并在巴东县信陵镇范围内进行推广。测试结果显示,阳光板粪污发酵池产物肥力显著高于三级化粪池三级产物肥力,使用本产物的果园果树生长良好。本研究成果将促进山区中小规模化畜禽养殖布局进一步规范,粪污治理无害化、减量化、资源化,最终实现全量利用,粪污变废为宝。