摘要：目的:构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果:Ppif的短发夹RNA(shRNA)片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。

摘要：目的:应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制大鼠基因Ppif的表达,探讨其对大鼠肾细胞(NRK)增殖和凋亡的影响。方法:体外化学合成针对Ppif基因的siRNA序列,在脂质体介导下转染NRK细胞,RT-PCR检测Ppif mRNA表达水平,Western blot检测Ppif蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡状况,MTT法检测细胞增殖活性。结果:Ppif siRNA转染NRK细胞24 h后,所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比,起始于405、556位点的siRNA在基因水平对Ppif无明显抑制效应(P>0.05);起始于198位点的siRNA在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75.25%(P<0.05);蛋白水平下降72.13%(P<0.05)。MTT结果显示NRK细胞增殖能力显著增加,转染24 h后,siRNA1～siRNA4细胞抑制率分别为(68.6±3.6)%、(5.3±4.3)%、(7.6±6.3)%和(4.1±4.5)%,凋亡率明显下降。结论:体外化学合成的Ppif siRNA(起始于198位点)可以有效地抑制NRK细胞Ppif的表达,从而抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。

摘要：目的探讨预输注转染白细胞介素12p35亚基干扰RNA(Ib-12p35siRNA)的供者来源树突状细胞对移植心脏存活时间的影响。方法制备供者BALB/c小鼠骨髓来源的树突状细胞,培养7d后,根据实验设计,分别以携带IL-12p35siRNA或HKsiRNA的重组腺病毒载体转染树突状细胞。移植前7d,经受者C57BL/6小鼠尾静脉注射转染IL-12p35siRNA的树突状细胞(p35组)和转染HKsiRNA的树突状细胞(HK组),并设未转染的对照组(未转染组),然后进行供、受者间的异位(颈部)心脏移植。术后观察移植心脏的存活情况,术后第14d采取静脉血,以酶联免疫吸附试验测定血清中自细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-10和γ干扰素(INF-γ)的水平。结果术后未转染组移植心脏的存活时间为(7．83±1．61)d,HK组为(7．17±1．60)d,p35组移植心脏存活时间明显延长,为(20．17±2．71)d,与HK组和未转染组相比,差异有统计学意义(P＜0．01)。p35组IL-2和INF-γ的水平明显低于HK组和未转染组(P＜0．01),而IL-4和IL-10的水平明显高于HK组和未转染组(P＜0．01)。结论预输注转染IL-12p35siRNA的供者树突状细胞能延长同种小鼠移植心脏的存活时间。

摘要：目的　探讨抗主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子的锤头状核酶对Raji细胞表面经典MHCⅡ类抗原表达的抑制作用。方法　设计并克隆针对MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)第134、218、464位点的3 个核酶片段(Rz134、Rz218、Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM T载体,进行细胞外切割活性筛选。将切割作用明显的Rz464 亚克隆入真核表达载体pIRES2 EGFP,成为pIRES2 EGFP Rz464(pRz464),将pRz464稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测Raji细胞表面MHCⅡ类抗原(HLA DR、DP、DQ)的表达,并用逆转录聚合酶链反应分析Raji细胞CⅡTA mRNA的表达。结果　转染pRz464 的Raji细胞表面HLA DR、DP、DQ抗原表达抑制率分别为95.93 %、94.14 %及98.32 %,同时其CⅡTA mRNA的表达显著下调(P<0.05)。结论　Rz464可抑制Raji细胞表面MHCⅡ类抗原的表达。

摘要：目的:分析HTK液单纯低温保存和常温体外肝脏灌流(ECLP)保存无心跳供肝的效果,探讨一氧化氮(NO)和内皮素(ET)在其过程中的作用和可能的机制。方法:按保存方法不同将无心跳供肝随机分为2组,再根据不同的阶段进行设计。A组(n=4)供肝用HTK液低温保存10h;B组(n=4)供肝用ECLP系统常温灌流10h。2组供肝经过60min再灌流前准备期后连接ECLP系统灌流4h。观察灌流后不同时间点供肝的胆汁分泌量、血流动力学和耗氧率的变化,以及灌流液中NO、ET水平和灌流后的供肝病理变化。结果:B组肝脏在1、2、3、4h4个时间点胆汁分泌量多于A组,耗氧率和A组(HTK液保存组)比较1h降低,2、3、4h升高(P<0.05或P<0.01);灌流液中在各个时间点B组ET水平均低于A组,NO则高于A组(P<0.05或P<0.01);常规病理和超微病理检查显示B组病变明显较A组轻。结论:在无心跳供肝保存过程中NO和ET起着非常重要的作用,利用ECLP系统灌流无心跳供肝能够通过改善NO和ET的平衡关系来更好地维持其生理活性和功能。

摘要：目的改进小鼠胰岛的分离、纯化及移植方法。方法基于传统小鼠胰岛移植模型,优化胶原酶消化液配方,标准化胰腺组织的消化过程,改用Histopaque 1077作为纯化胰岛的离心介质,改进胰岛制备物输送至肾包膜下的方法;相差显微镜下观察所获胰岛的形态,用双硫腙(DTZ)对胰岛进行特异性染色并计算胰岛产量及纯度;采用吖啶橙-碘化丙啶(AO-PI)染色法观察胰岛活性;制备糖尿病小鼠模型,设计胰岛移植组(10只)及假手术对照组(10只),检验胰岛移植物治疗糖尿病的效果。结果健康胰岛有完整包膜,DTZ染色后呈猩红色,平均每只小鼠可收获(200±30)个胰岛团,终纯度(90±5)%;荧光显微镜下,AO-PI染色后,正常胰岛显示绿色,死亡胰岛显示红色,胰岛存活率为(93±3)%;糖尿病小鼠接受同系胰岛移植后,90%的小鼠逆转糖尿病,对照组小鼠的血糖无改善。结论成功改进胰岛移植模型,简化和标准化小鼠胰岛的分离、纯化及移植过程,有助于该模型成为胰岛移植研究的常规方法。

摘要：目的:探讨抗CⅡTA核酶对肝细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制作用。方法:设计并克隆针对CⅡTA第134、218及464位点的核酶(分别为Rz134、Rz218、Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性筛选。将切割作用明显的Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP(pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464)进行细胞内切割分析。pRz464稳定转染人胎肝细胞,流式细胞术检测MHCⅡ(HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ)类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTAmRNA水平。结果:pRz464肝细胞表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的诱导型表达分别为(1.01±0.51)%、(4.37±1.28)%和(1.98±0.42)%,与对照组比较分别下调90.65%、89.11%及65.32%;同时CⅡTA的诱导型mRNA含量明显减少(P<0.01)。结论:抗CⅡTA核酶-Rz464降低了CⅡTA的mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

摘要：目的探讨利用ECLP系统来复苏经历了较长热缺血时间的无心跳供肝功能的可能性和机制,为临床有效地利用热缺血时间超过安全时限的无心跳供肝提供一种思路和理论依据。方法实验动物为普通健康的天津白猪,体重在20～25 kg之间,雌雄不拘。无心跳供肝按热缺血时间和保存方法的不同随机分为3组,再根据不同的阶段进行设计。A组(n=4)无心跳供肝的热缺血时间在安全时限内,用HTK液低温保存10 h;B组(n=4)无心跳供肝的热缺血时间为60 min,用HTK液在低温保存10 h;C组(n=4)无心跳供肝的热缺血时间为60 min,用ECLP系统常温灌流10 h。经过60 min冷缺血期后,连接ECLP系统再灌流。观察再灌流时间和1 h、2 h、3 h、4 h四个时间点的胆汁分泌量和门静脉和肝动脉的压力,耗氧率的变化,以及灌流液中ALT、LDH、葡萄糖水平和灌流后的常规病理和超微病理变化。结果B组(HTK液保存组)肝脏在再灌流后短时间内肿胀,没有胆汁分泌,常规病理和超微病理显示正常结构破坏,出现不可逆性的损伤。C组(ECLP系统灌流组)肝脏在再灌流初期胆汁分泌量、门静脉和肝动脉的压力、耗氧率和灌流液中葡萄糖水平和A组(安全时限组)差异有显著性(P0.05)。常规病理和超微病理变化显示肝脏结构完整,较轻度病变。结论热缺血时间为60 min的无心跳供肝在HTK液低温保存10 h后已基本失去生理活性与功能,利用ECLP系统灌流能够在一定程度上复苏热缺血时间较长的无心跳供肝。

摘要：随着第五代移动通信技术和人工智能技术的发展,医疗相关的各领域全面进行信息化升级,步入智慧医疗时代。本研究基于浏览器/服务器模式架构,构建人体捐献器官获取全流程远程交互系统,对病史采集、伦理程序、获取手术、器官评估和病例总结等工作进行全流程数字化管理,实现结构化存储供者相关数据及指标,以及对历史数据进行回溯、分析和统计。该系统已应用于华中科技大学同济医学院附属同济医院器官获取组织的日常工作,实现了对供者的精细评估和全面监测管理,提高了捐献器官利用率,也为科学研究、人员培养、标准制订和兄弟单位合作等提供价值,具有极大的临床推广意义。

摘要：我国遗体捐赠和利用事业存在亟待突破的现实困境,虽然我国有着庞大的人口基数,但是遗体以及器官的供应仍然严重不足,陷入这一困境的原因是多方面的,替代同意权制度的不清晰、不完善是导致这一问题出现的重要原因,通过总结各地地方立法和司法实践中的经验,通过科学设计替代同意权、加大捐赠鼓励力度、设置受益人义务等方法,并将其融入立法之中,使之与"健康中国"的战略相契合,破解遗体捐赠不积极的现实困境。