摘要：目的探讨人乳头状瘤病毒（HPV）16型多肽疫苗的制备，并观察HPV16多肽疫苗的体内外效应。方法（1）针对抗原加工相关转运子（TAP）设计HPV16E7蛋白的主要组织相容性复合物I类分子（MHC—I）的抗原结合表位，利用生物信息学分析平台筛选出一致性较高、特异性及亲和力较强的HPV16E7多肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗用于以下研究，本研究共筛选出3段多肽，分别命名为E7Pa、E7Pb、E7Pc。（2）C57BL／6小鼠注射鼠肺上皮细胞株TC-1细胞（为鼠源性的HPV16阳性的肿瘤细胞株）后，采用等额抽取的随机方法分为5组，E7Pa＋二核苷胞嘧啶（CpG）、E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG[均为实验组，分别加入终浓度为50μg／ml的E7Pa、E7Pb、E7Pc和终浓度为12mg／L的刀豆蛋白（ConA）]、CpG（为阳性对照，加入终浓度为12mg／L的ConA）和空白对照组（不做任何处理）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测各组作用不同时间后小鼠脾T淋巴细胞的体外增殖效应，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测小鼠脾T淋巴细胞在不同效靶比下的体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性，实时荧光定量RT—PCR技术检测小鼠肿瘤组织中1干扰素（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）mRNA的表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2的表达水平，通过定期测量比较各组小鼠接种HPV16多肽疫苗后体内肿瘤体积的变化。结果（1）本研究筛选出了一致性较高、特异性及亲和力较强的3段HPV16E7多肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗，分别命名为E7Pa、E7Pb、E7Pe。（2）MTT比色法检测显尔，在接种疫苗24、48、72、96h后，以E7Pa＋CpG组的增殖效应最明显，其细胞增殖率分别为（131±32）％、（302±15）％、（552±28）％、（731±24）％，明显高于空白对照组的（72±15）％、（120±57）％、（176±41）％、（288±29）％（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpC组的细胞增殖率也均明显高于空白对照组（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。LDH释放法检测显示，效靶比为100：1时，E7Pa＋CpG、E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpG和空白对照组CTL活性分别为（85．9±3．0）％、（55．9±2．5）％、（60．2±1．5）％、（41．0±1．7）％和（4．1±1．0）％，E7Pa＋CpG组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG、CpG组分别与李白对照组比较，差异也有统计学意义（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。在肿瘤组织及外周血中，小鼠IFN-γ、IL-2的表达水平，E7Pa＋CpG组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG和CpG组分别与空白对照组比较，差异也均有统计学意义（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。小鼠体内的肿瘤体积，各实验组肿瘤生长均明显被抑制，接种后第60大，E7Pa＋CpC组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG和CpG组分别与空白对照组比较，差异也均有统计学意义（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。结论在动物模型中，针对TAP筛选的HPV16E7多肽联合cpG制备的HPV16多肽疫苗，可以有效治疗HPV16E7阳性的肿瘤。

摘要：目的:探讨利用RNA干扰技术下调Smad 4基因表达对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响,初步了解Smad 4在血管生成中的作用。方法:设计并合成靶向人Smad4基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段siRNA1和siRNA2,脂质体介导转染入人脐静脉内皮细胞株ECV304。应用实时定量RT-PCR和Western印迹法检测转染前后Smad4基因表达水平;应用细胞周期分析和羧乙基锗倍半氧化物(6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)-流式细胞仪检测ECV304细胞转染前后细胞增殖能力的变化;通过单层细胞划痕实验观察细胞转染前后迁移能力的变化。结果:从2条siRNA中成功筛选出1条siRNA,于RNA和蛋白水平可明显下调Smad4基因的表达;ECV304细胞转染Smad4的siRNA后,细胞的增殖和迁移能力明显增强。结论:利用RNA干扰技术能够筛选出高效的特异阻断Smad4基因表达的siRNA;Smad4基因表达下调能够明显促进血管内皮细胞的增殖和迁移。

摘要：目的 探讨人乳头状瘤病毒（HPV）16型多肽疫苗联合紫杉醇＋顺铂（TP）化疗方案治疗宫颈癌的可行性,并观察其体内外效应.方法 （1）针对抗原加工相关转运子（TAP）设计HPV16E7蛋白的主要组织相容性复合物Ⅰ（MHC-Ⅰ）抗原结合表位,利用生物信息学分析平台结合体内外实验研究,筛选出一敛性较高、特异性及亲和力较强的HPV16 E7多肽,命名为E7Pa.（2）C57BL/6小鼠注射鼠肺上皮细胞株TC-1细胞（为鼠源性的HPV16阳性的肿瘤细胞株）后,采用等额抽取的随机方法将样本分为6组,E7Pa＋CpG＋TP、E7Pa＋CpG、CpG＋TP、TP和CpG组均为实验组及空白对照组（予生理盐水注射组）.通过定期测量,绘制肿瘤生长曲线,比较各组小鼠肿瘤体积的变化;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠外周血中γ干扰素（INF-γ）、白细胞介素2（IL-2）的表达水平;TUNEL试剂盒检测肿瘤组织的细胞凋亡情况;记录各组动物自接种肿瘤细胞开始至死亡的时间,绘制生存曲线;作小鼠相关脏器病理检查及白细胞计数观察治疗的安全性.结果 肿瘤生长第60天时,E7Pa＋CpG＋TP组肿瘤体积为（0.013±0.010）cm3与空白对照组（1.900±0.075）cm3相比,差异有统计学意义（P＜0.01）;E7Pa＋CpG组体积为（0.340±0.038）cm3、TP＋CpG组体积为（0.650±0.029）cm3、TP组体积为（1. 100±0.052）cm3,CpG组体积为（0.890±0.047）cm3,分别与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;小鼠的平均生存时间E7Pa＋CpG＋TP组（108.50±8.97）d,E7Pa＋CpG组（100.02±2.27）d,CpG＋TP组（79.63±4.05）d,TP组（73.24±3.11）d,CpG组（68.63±1.38）d,对照组（52.37±2.47）d,E7Pa＋CpG＋TP组及E7Pa＋CpG组平均生存期与对照组比较生存期明显延长,差异有统计学意义（P＜0.01）;同时,免疫治疗组可有效的激发自身免疫系统活化对抗肿瘤细胞的恶性增生,而化疗组可以显著杀伤恶性细胞,诱导凋亡.免疫治疗与化疗的联用明显优于两者单用,可以在充分调动自身免疫杀伤效应的同时增加化疗药物的抗肿瘤效应.在药物副作用的研究中,联合用药与其他实验组差异无统计学意义.结论 在动物模型中,人乳头状瘤病毒16型多肽疫苗联合紫杉醇＋顺铂化疗可以有效治疗HPV16 E7阳性的肿瘤.

摘要：背景与目的:MT1-MMP(MMP-14)是新发现的一种膜型基质金属蛋白酶,研究表明MT1-MMP在肿瘤转移中发挥关键性作用。本研究应用反义核酸技术,观察了MT1-MMP反义核酸对高转移人卵巢癌SW626细胞体外生长和侵袭的抑制效应。方法:应用自行设计的引物,借助RT-PCR技术获得两端含不同限制酶位点的MT1-MMPcDNA片段,反向插入pcDNA3.1中,并应用脂质体介导的基因转染技术,将重组质粒导入SW626细胞中,应用MTT、Westernblot、明胶酶谱和体外侵袭实验等方法观察了SW626细胞转染前后,细胞生长、MT1-MMP蛋白表达、MMP-2和MMP-9酶活性及细胞体外侵袭能力等指标的变化。结果:成功构建了反义MT1-MMP真核表达载体(pMMP14as),将其转染入SW626细胞后,与空质粒转染组相比,MT1-MMP反义核酸转染组细胞MT1-MMP表达显著降低,抑制率为65.8%;MMP-2酶原的活化受到明显抑制;pMMP14as转染组的穿膜细胞百分数为(63.3±5.8)%,明显低于空质粒转染组(97.6±7.5)(P<0.05)%。结论:MT1-MMP反义核酸可明显抑制高转移SW626细胞体外生长和侵袭效应,提示MT1-MMP可作为人卵巢癌抗侵袭治疗的分子靶点。

摘要：细胞(增殖周期)动力学研究细胞群体生长、繁殖、分化、丢失和死亡等运动变化的规律.肿瘤组织主要由增殖和非增殖细胞群组成,绝大多数细胞毒素型的抗肿瘤药对增殖周期中的各期细胞有不同的影响.因此,了解细胞动力学知识,对深入认识肿瘤细胞繁殖过程和特点及药物作用原理,正确制定肿瘤药物治疗方案及新药研究都有很大的帮助.

摘要：目的:探讨用RNA干扰技术下调smad 4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法:用DNA重组技术将针对人smad 4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4 shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果:成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil-smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con,三种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4 mRNA及smad4蛋白表达,筛选出的HeLa/shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论:应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad 4基因表达及功能的shRNA,smad 4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。

摘要：宫内节育器(intrauterine device,IUD)是一种广泛应用的女性长效避孕方法之一,具有安全、有效、简便、经济的优点。尽管IUD有诸多优点,但仍存在一些不良反应影响其使用,尤其是异常出血占有很大比重。对异常出血不良反应的机制研究具有重要的意义,可以为新型IUD的设计及开发提供理论依据及新思路。本文对含铜IUD异常出血不良反应机制的研究进展做一综述。

摘要：目的构建DNA-PKcsshRNA表达载体,观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响。方法将针对人DNA-PKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞,RT-PCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率,MTT法测定DNA-PKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果 DNA测序分析证实DNA-PKcs shRNA表达载体pSIRENDNA-PKcs shRNA构建成功并在细胞中表达,转染重组载体的A2780细胞DNA-PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降;重组载体转染细胞增殖活性明显降低。结论成功构建DNA-PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA损伤修复基因DNA-PKcs奠定了基础;DNA-PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低。

摘要：目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到空载体Pgenesil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功,并被成功转入宫颈癌HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达,48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。

摘要：目的针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实:3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。