摘要：目的　探讨白血病细胞多药耐药发生的分子机理,寻找新的多药耐药相关基因。方法　以HL- 6 0细胞为“驱动方”,以多药耐药细胞系HL- 6 0 / VCR为“实验方”,建立人白血病多药耐药细胞系HL-6 0 / VCR抑制消减杂交文库,利用基因芯片技术从中筛选出一条在野生型HL - 6 0细胞中基本不表达,而在HL - 6 0 / VCR耐药细胞中呈低丰度差异表达的新表达序列标记序列。用表达序列标记拼接的同源基因克隆法得到人类新基因HV12 6序列,再利用生物信息学数据库和软件对其进行功能的预测和分析。最后针对推导序列开放阅读框设计引物,逆转录-聚合酶链反应检测推导HV12 6基因序列在临床白血病患者化疗前后白血病细胞中的表达。结果　HV12 6的c DNA序列长1991bp,编码36 5个氨基酸,其编码蛋白序列局部与新近发现的在细胞凋亡与炎症反应中起重要作用的蛋白基序“PYRIN”存在约4 3%的相似性。逆转录-聚合酶链反应结果提示该基因与白血病细胞受化疗药物的作用和耐药存在联系。结论　HV12 6可能是与白血病细胞耐药相关的一条新基因,有必要对该基因进行进一步的实验室克隆与功能研究。

摘要：目的　研究抗fas的锤头状核酶对小鼠细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)系CTLL 2细胞fas基因的表达及其介导的细胞凋亡抑制作用 ,探索供者淋巴细胞输注 (DLI)时增强T细胞抗白血病的新途径。方法设计并合成抗fas的锤头状核酶基因 ,将其导入CTLL 2细胞 ,通过RT PCR、Westernblot和流式细胞仪分别检测核酶对CTLL 2细胞fasmRNA和Fas蛋白表达的抑制 ,以MTT法检测CTLL 2细胞与Fas抗体结合后的增殖活性 ,以半胱天冬酶 3(caspase 3)活性检测试剂盒检测细胞caspase 3蛋白酶活性 ,以流式细胞仪检测细胞凋亡 ,以乳酸脱氢酶法检测CTLL 2细胞的体外杀伤活性。结果锤头状核酶基因导入CTLL 2细胞后 ,可使其表面的Fas表达降低达 5 0 % ,细胞经Fas抗体 (JO2 )处理后 ,与空白对照、转染空载体的细胞相比 ,转染核酶的细胞增殖活性增加了 1倍 ,caspase 3活性降低近 5 0 % ,而细胞的凋亡率显著降低 ,只有 37% ,且CTLL 2细胞的体外杀伤活性为对照组的 2倍。结论该核酶具有切割fas基因的良好活性 ,并可抑制Fas介导的CTLL 2细胞凋亡 ,增加该细胞存活率 ,从而增强对Yac 1细胞的杀伤活性。

摘要：目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径.方法设计合成针对PLK1基因1416～1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1.通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1 shRNA重组质粒转染组,转染后24,48 h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况.结果PLK1 mRNA相对水平(与内参的灰度比值):对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48 h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48 h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P＜0.01).各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1 mRNA表达相似.相应地,对照组、空载体转染48 h组、shRNA重组质粒转染24,48 h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P＜0.05).此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P＜0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加.以上结果均于转染后48 h时较明显(P＜0.05).结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加.

摘要：背景与目的:化疗药物的细胞周期特异性是临床设计化疗方案的重要依据。一般认为,紫杉醇为G2/M期特异性化疗药物。但是近来的相关研究却表明,药物在体内的细胞周期特异性可能与体外不同。本研究旨在观察紫杉醇作用于不同生长状态下白血病细胞的细胞周期特异性有无改变。方法:利用流式细胞分析技术,对紫杉醇作用于人急性淋巴细胞性白血病细胞株Molt-4以及作用于17例急性白血病细胞所诱导的凋亡效应进行了观察。结果:紫杉醇诱导在对数生长状态下的Molt-4细胞株G2/M期特异性凋亡,在高密度状态下培养的Molt-4细胞为G0/G1期特异性凋亡,而在临床标本中诱导S期特异性凋亡。结论:紫杉醇在不同模型诱导不同的细胞周期特异性凋亡。与一般认为的不同,紫杉醇引起患者白血病细胞S期特异性凋亡。这些不同很可能与细胞处于不同的生长状态有关。

摘要：目的构建jak2a野生型(wilde type,wt)载体并完成其在斑马鱼体内的过表达,运用邻联茴香胺染色观察其对红系造血的影响,为后续探讨斑马鱼骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders,MPD)模型的Jak/Stat信号通路奠定基础。方法根据jak2a基因GenBank NM_131093序列V581F突变位点上下游序列设计引物,以pGM-T-jak2a V581F质粒载体为模板进行PCR后,用DpnⅠ酶对产物进行消化去除模板,转化感受态细菌DH5α,通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落,小量提取质粒,NdeⅠ限制性内切酶线性化pGM-T-jak2a-wt质粒,运用T7Transcript Aid酶对jak2a基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。以200ng/μL浓度jak2a-wt mRNA加帽产物显微注射斑马鱼单胞期受精卵,运用邻联茴香胺染色检测其对红系增殖的影响。结果完成pGM-T-jak2aV581F的定点突变,成功构建pGM-T-jak2a-wt载体,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM_131093)一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-jak2a-wt,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。对过表达jak2a的鱼卵进行邻联茴香胺染色,发现斑马鱼卵黄囊及ICM区红细胞明显增多。结论成功完成斑马鱼pGM-T-jak2aV581F基因定点突变并体外转录及加帽pGM-T-jak2a-wt,体内过表达jak2a对红系发生有显著影响。

摘要：背景与目的:肿瘤细胞可表达FasL,从而诱导表达Fas的T细胞凋亡,即肿瘤细胞的“Fas反击作用”。本研究通过检测抗Fas核酶对小鼠T细胞凋亡的抑制作用,探索增强T细胞抗肿瘤能力的新途径。方法:设计并合成针对小鼠Fas基因的锤头状核酶,检测其对Fas m RNA的体外切割能力。通过电穿孔转染法将其导入小鼠脾脏T细胞,同时设立空白对照组和空载体转染组,通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR)、W estern blot检测细胞上Fas的表达。细胞经抗Fas的抗体(JO2)作用后,流式细胞仪检测细胞凋亡,M TT法测转染前后细胞的增殖,以乳酸脱氢酶试验检测细胞毒性T细胞的体外杀伤活性。结果:抗Fas核酶能显著切割Fas m RNA,切割效率为60%。核酶组细胞表面的Fas水平显著低于对照组及空载体组(0.4vs.1.1,1.0,P<0.01)。经抗Fas抗体处理后,核酶组细胞的凋亡率明显低于对照组及空载体组(35%vs.86%,87%,P<0.01);核酶组的细胞增殖活性显著高于对照组及空载体组(208%vs.100%,98%,P<0.01);核酶组T细胞的体外杀伤活性明显强于其它2组细胞(67%vs.32%,31%,P<0.01)。结论:抗Fas核酶能显著降低小鼠脾脏T细胞的Fas水平,使细胞免于Fas途径的凋亡,从而增强T细胞的抗瘤能力。

摘要：背景微小残留病变(MRD)用于监测和评估儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗反应,并根据MRD水平进行危险度分层。目的探讨ALL患儿化疗期间及结束化疗后定期监测MRD对复发的预后价值。设计回顾性队列研究。方法收集2015年1月至2020年2月华中科技大学同济医学院附属同济医院(我院)接受CCCG-ALL 2015方案化疗的初诊ALL连续病例的临床资料,使用流式细胞术检测MRD。分析定期监测MRD与早期预测复发之间的关系。主要结局指标无复发生存期(RFS)。结果224例患儿纳入本文分析,男134例,女90例,中位年龄4.8岁。①诱导缓解第19天(D19)MRD阳性104例(46.4%),第46天(D46)MRD阳性23例(10.3%)。从诱导缓解后(16周)至结束化疗(125周)MRD均阴性145例。结束化疗后随访期间(152~287周),13例MRD阳性,其中11例(84.6%)复发。②28例患儿复发,中位复发时间33月,14例存活,12例死亡,2例失访;20例骨髓复发,其中2例合并睾丸复发,1例合并中枢神经系统复发(CNSL);8例单纯CNSL。③224例患儿随访时间52(IQR:36.5~69.5)月,5年RFS(84.5±2.8)%。D46 MRD≥0.01%与<0.01%、诱导缓解后至结束化疗期间MRD均阴性与MRD至少1次阳性患儿的5年RFS差异均有统计学意义(P<0.05)。结论D46 MRD≥0.01%及诱导缓解后至结束化疗期间MRD至少1次阳性的患儿预后较差。化疗过程中定期监测MRD十分重要。

摘要：目的探讨转染组织因子胞内段小片段干扰RNA（siRNA）对血管内皮细胞凋亡的影响。方法体外设计组织因子胞内段siRNA I和siRNA II，插入质粒DNA后用脂质体将其转入人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）中。3组HUVEC分别转染siRNAI质粒（siRNA I组）、siRNA II质粒（siRNAII组）和pcDNA^TM 6．2GW／-miR质粒（对照组）。取各组HUVEC细胞，分别与CD8^＋T淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应。用流式细胞仪检测混合淋巴细胞反应中HUVEC的凋亡率，用磁珠法检测混合淋巴细胞反应上清液中活化部分凝血活酶时间（APTT）。结果插入的siRNA经过测序，证实为正确序列。HUVEC转染siRNA后24h及48h，siRNA I组和siRNA II组HUVEC的凋亡率均低于对照组（P〈0．01）。siRNAI组HUVEC的凋亡率低于siRNA II组（P〈0．05）。3组上清液的APTT较对照（RPMI1640培养基）缩短（4±0．46）s（P〈0．05）。siRNA I组和siRNA II组与对照组相比较，APTT的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论组织因子胞内段siRNA构建成功。转染该siRNA可在不影响凝血功能的情况下对混合淋巴细胞反应中的内皮细胞起到一定保护作用，减少内皮细胞的凋亡。

摘要：以高表达Polo样激酶1(Polo-likekinase1,PLK1)的宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型,观察针对PLK1基因的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对其凋亡和增殖的影响.设计并合成了针对PLK1的shRNA,将其导入构建的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的RNAi(RNAinterference)表达载体中.通过RT-PCR和Western印迹分别检测HeLa细胞PLK1基因和蛋白水平的表达,以流式细胞仪和PI-Hochest双染法测细胞凋亡,MTT法检测细胞的增殖水平.成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1.转染shRNA后,HeLa细胞PLK1的表达降低至30%.与对照组和空载体转染组相比,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,其增殖活性则明显降低.本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况,且不影响H1启动子的体内转录.PLK1的基因沉默能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,有可能为未来肿瘤的治疗找到新的靶点和有效途径.

摘要：白血病细胞表面可高表达FasL ,诱导表达Fas的T细胞凋亡 ,从而降低其抗白血病的作用 .以高表达Fas的小鼠淋巴瘤细胞系Yac 1作为模型 ,设计并合成了针对FasmRNA 5 96位点的锤头状核酶基因 ,用T7/SP6体外转录系统检测了该核酶对FasmRNA的体外切割效率 ,通过电穿孔转染法将其导入Yac 1细胞 ,通过RT PCR、Western印迹法检测细胞上Fas的表达 .细胞经抗Fas的抗体作用后 ,通过MTT法测细胞的增殖 ,annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒测细胞凋亡 .该核酶体外切割活性达6 0 % ,且能有效降低细胞表面Fas的表达 ;细胞经抗Fas的抗体作用后 ,转染核酶的细胞增殖活性较对照增高 ,而凋亡率明显降低 .结果表明 ,构建的切割FasmRNA核酶在体内外均具备良好的切割FasmRNA的活性 ,使细胞免于Fas途径的凋亡 ,为研究抑制T细胞的凋亡从而增强其抗白血病效应提供实验基础 .