摘要：目的探讨RNA分子干扰铜绿假单胞菌MexAB—OprM外排泵MexB基因的体内效应。方法针对MexAB-OprM外排泵MexB基因设计siRNA小分子，构建干扰RNA（shRNA）表达载体，将带有小分子干扰RNA（siRNA）质粒电转入铜绿假单胞菌，从小鼠支气管内直接予以siRNA质粒干扰PAO琼脂菌体悬液（1×10^7CFU／ml）攻击，建立PA01野生型及siRNA2干扰型和siRNA阴性对照分子干扰型菌株的肺部感染动物模型。于感染后第1、2、3天腹腔注射美罗培南（100mg／kg，2次／d）。感染后第3、5、7天评估各组小鼠肺部细菌学、肺部病理学、细胞因子水平及肺组织中性粒细胞募集（MPO）水平变化。结果siRNA2干扰组小鼠，感染后3、5、7d的肺部细菌负荷明显下降。且与siRNAnon组和ScrambledsiRNA组比较，siRNA2干扰组小鼠感染早期（3d）病理学改变明显减轻；MPO及炎性细胞因子（IL-1β和IL-12）表达水平升高。而在感染后期（7d）siRNA2干扰组小鼠炎性细胞因子表达水平则下降。结论siRNA分子干扰明显增加小鼠对铜绿假单胞菌感染的抵抗力，降低肺部细菌的载量，增加早期中性粒细胞募集到感染部位并诱导铜绿假单胞菌的早期免疫应答。siRNA分子联合抗生素的治疗，为慢性铜绿假单胞菌肺部感染的治疗提供了有意义的资料。

摘要：喉罩自1983年由Brain^[1]发明以来，已经广泛应用于临床。大样本研究表明，喉罩用于机械通气是安全有效的^[2,3]，在很多方面有着气管插管不可替代的优点，欧普乐喉罩（OPIJAC）在经典喉罩的基础上做了改良，是由中国人设计的一种新型的一次性无充气罩喉罩，可减免充气罩压力过大导致的口咽部并发症，已用于临床。由于喉罩的气道密封机制始终不如气管导管机制可靠^[4]．

摘要：目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。

摘要：目的:构建Cyr61靶向siRNA重组表达载体,为探讨抑制Cyr61基因表达对机械通气所致肺损伤的研究奠定基础。方法:根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录siRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 siRNA,Cyr61-2 siRNA,Cyr61-3 siRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果:经酶切鉴定和测序结果证实Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论:Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达。

摘要：目的:探讨用RNA干扰技术下调smad 4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法:用DNA重组技术将针对人smad 4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4 shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果:成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil-smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con,三种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4 mRNA及smad4蛋白表达,筛选出的HeLa/shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论:应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad 4基因表达及功能的shRNA,smad 4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。

摘要：目的构建大鼠永生化神经前体细胞（INPC）CDH1小干扰RNA（siRNA）真核载体。方法根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA（shRNA）干扰序列及1个阴性对照序列，根据pENTR／H1／TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链，退火后分别连接到pENTR／H1／TO线性载体上，形成完整载体，提取CDH1 siRNA真核载体后（分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1 siRNA3和CDH1 siRNA对照），进行DNA测序鉴定。采用Lipofectamine 2000法，分别将成功构建的CDH1 siRNA真核载体转染大鼠INPC，于转染24h和48h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数／细胞总数，于转染48h时提取细胞总RNA，采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达。结果经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确，无碱基突变或缺失；INPC转染24h与48h时转染效率分别为（54±5）％和（36±4）％；CDH1 sinNA2转染INPC 48h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低，且两者均低于CDH1 siRNA1（P〈0．05）。结论本研究成功构建大鼠INPC CDH1 siRNA真核载体。

摘要：背景:长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。目的:设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。方法:根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。结果与结论:酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。

摘要：目的针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实:3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。

摘要：背景:有证据表明罗哌卡因导致的心脏毒性比相同剂量的布比卡因低,但布比卡因脂溶性高,且作用强度大,临床上只需较小的剂量即可。中枢神经系统明显的神经毒性作用(如惊厥)往往是心脏毒性产生的先兆,半数致死剂量和半数致惊厥剂量的比值能够反应局麻药的安全性。目的:确定罗哌卡因、布比卡因、利多卡因的半数致惊厥剂量和半数致死量,比较在引起50%致惊厥反应率时3种酰胺类局部麻醉药对中枢神经系统的毒性作用。设计:随机对照,3个实验各自独立。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科。材料:实验于2002-07/12在武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室完成。选取1月龄雄性昆明小白鼠310只,清洁级。方法:①局麻药剂量与致惊厥率及致死率关系的确定:选择240只小鼠,确定罗哌卡因的量效关系时采取的小鼠数量为50只,分为76.80,68.69,61.44,49.15,31.46mg/kg5种剂量,10只/剂量组;确定布比卡因的量效关系时采取的小鼠数量为90只,分为50.00,47.29,44.72,42.29,40.00,35.78,32.00,28.62,25.60mg/kg9种剂量,10只/剂量组;确定利多卡因的量效关系时采取的小鼠数量为100只,分为183.11,163.77,146.48,131.02,117.19,93.75,75.00,60.00,48.00,38.40mg/kg10种剂量,10只/剂量组。不同剂量的局麻药腹腔注射时,尽量使每种麻醉药致各组小鼠的惊厥率和致死率对称分布在50%左右,给药5min后记录各组的致惊厥率和死亡率。使用Probit法将量效曲线直线化,建立3种局麻药的对数剂量一概率单位的回归直线方程,确定各自的量效关系。②不同剂量利多卡因对小鼠惊厥时间和大脑c-Fos表达的影响:选择40只小鼠,随机分成4组:空白对照组、30%致惊厥剂量组、60%致惊厥剂量组、90%致惊厥剂量组,10只/组。空白对照组腹腹腔注射生理盐水,利多卡因各剂量组依次腹腔注射47,57,73mg/kg的利多卡因,观察并记录各组小鼠惊厥的持续时间。将发生惊厥的小鼠妥善标记,2h后制作冰冻冠状切片,检测神经元核蛋白c-Fos的表达,镜下计算不同区域表达c-Fos的棕黄色颗粒数目,每个颗粒代表1个神经元。③50%致惊厥剂量的局麻药对小鼠毒性反应的测定:选择30只小鼠,随机分成3组:罗哌卡因组、布比卡因组、利多卡因组,10只/组。各组依次腹腔注射50%致惊厥剂量的对应局麻药后,对发生惊厥的小鼠观察其惊厥持续时间,2h后制作冰冻冠状切片,免疫组织化学ABC法检测神经元核蛋白c-Fos的表达。主要观察指标:观察小鼠对腹腔注射不同局麻药的反应,记录惊厥持续时间,使用免疫组织化学方法检测小鼠脑组织c-Fos蛋白的表达。结果:实验选用310只小鼠,全部进入结果分析。①各种局麻药不同剂量与惊厥及死亡率的关系:利多卡因、布比卡因、罗哌卡因的治疗指数穴半数致死量/50%致惊厥剂量雪分别为2.89,1.48,1.34。②利多卡因致小鼠惊厥后脑组织c-Fos蛋白的表达情况:表达c-Fos蛋白的神经元主要分布在侧脑室以下,第3脑室周围的丘脑区域;正中隆起以上,第3脑室旁边的下丘脑区域;以及下侧部皮质的梨状皮质与杏仁体。③不同剂量利多卡因致小鼠惊厥持续时间和c-Fos阳性神经元数目的比较:与空白对照组比较,30%,60%,90%致惊厥剂量组的惊厥持续时间呈逐渐上升趋势(P均0.05雪,而罗哌卡因均显著高于利多卡因组和布比卡因组穴P<0.05雪。结论:罗哌卡因在临床麻醉中的使用剂量较少超过布比卡因,很少达到其致惊厥剂量,具有较高的安全性。但一旦发生中枢毒性反应,罗哌卡因导致的惊厥则会更加严重,可能与其脂溶性低,吸收后分布容积小,血浆浓度高有关。

摘要：目的 探讨非心脏手术患者术后早期谵妄（EPD）与预后的关系.方法 采用前瞻性队列研究设计,选择2009年6月至12月在本院全麻下行非心脏手术患者698例,收集影响患者预后的相关因素,根据CAM-ICU诊断标准判断是否发生EPD,分为EPD组和非EPD组（NEPD组）,以术后住院时间作为主要预后指标,将EPD和对术后住院时间有影响的混杂因素纳入Cox比例风险回归模型进行分析,筛选影响患者预后的危险因素.结果 EPD组197例,NEPD组501例,EPD发生率28.2%,EPD组患者术后住院时间长于NEPD组,EPD是影响患者预后的独立危险因素之一.结论 EPD是影响非心脏手术患者预后的独立危因素之一.